Utilizzando ad alta risoluzione Tomografia Computerizzata Per visualizzare la struttura tridimensionale e funzione delle piante Vasculature
Summary
Alta risoluzione x-ray tomografia computerizzata (HRCT) è una tecnica non distruttiva imaging diagnostico che può essere utilizzata per studiare la struttura e la funzione della vascolarizzazione dell'impianto in 3D. Dimostriamo come HRCT facilita l'esplorazione di reti xilematici in una vasta gamma di tessuti e specie vegetali.
Abstract
Ad alta risoluzione x-tomografia computerizzata a raggi (HRCT) è una tecnica non distruttiva di diagnostica per immagini con sub-micron capacità di risoluzione che viene ora utilizzato per valutare la struttura e la funzione della rete di impianti xilema in tre dimensioni (3D) (ad esempio, Brodersen et al . 2010; 2011; 2012A, b). HRCT immagini si basa sugli stessi principi della medicina sistemi CT, ma una ad alta intensità di sincrotrone a raggi X Fonte dei risultati a maggiore risoluzione spaziale ed è diminuito il tempo di acquisizione delle immagini. Qui, abbiamo dimostrato in dettaglio come sincrotrone a base di HRCT (eseguita presso l'Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combinazione con il software Avizo (VSG Inc., Burlington, MA, USA) viene utilizzato per esplorare xilema stabilimento di asportato tessuto e piante viventi. Questo strumento di imaging consente agli utenti di andare al di là tradizionale statica, luce 2D o microscopio elettronico e di campioni di studio virtuali utilizzando sezioni seriali in qualsiasi piano. Un numero infinito di fette in ogni c orientamentoun essere effettuata sullo stesso campione, una caratteristica che è fisicamente impossibile utilizzando metodi di microscopia tradizionali.
I risultati dimostrano che la HRCT può essere applicato sia erbacee e specie di piante legnose, e una serie di organi vegetali (foglie, cioè piccioli, steli, tronchi, radici). Le cifre qui presentate contribuire a dimostrare sia una serie di anatomia vascolare rappresentante dell'impianto e il tipo di dettaglio estratto da set di dati HRCT, comprese le scansioni per Coast Redwood (Sequoia sempervirens), noce (Juglans spp.), Quercia (Quercus spp.), E acero ( Acer spp.) alberelli di girasole (Helianthus annuus), viti (Vitis spp.), e felci (Pteridium aquilinum e Woodwardia fimbriata). Campioni asportati ed essiccati di specie legnose sono più facili da eseguire la scansione e genere permette di ottenere le immagini migliori. Tuttavia, i recenti miglioramenti (ad esempio le scansioni più rapide e la stabilizzazione del campione) hanno reso possbile utilizzare questa tecnica di visualizzazione su tessuti verdi (es piccioli) e in piante viventi. In occasione alcuni restringimento di idrati tessuti vegetali verdi farà sì che le immagini di sfocatura e metodi per evitare questi problemi sono descritti. Questi progressi recenti con HRCT fornire promettenti nuove intuizioni funzione di piante vascolari.
Introduction
L'acqua viene trasportata dalle radici alle foglie delle piante in un tessuto vascolare chiamato xilema – una rete di condotti interconnessi, fibre, e di vita, le cellule metabolicamente attive. Funzione di trasporto delle xilema impianto deve essere mantenuto per la fornitura di acqua e sostanze nutritive alle foglie per la fotosintesi, la crescita, e in ultima analisi, la sopravvivenza. Trasporto dell'acqua in condotti xilematici può essere interrotta quando la rete xilema è compromessa da germi patogeni. In risposta a tali impianti infezioni spesso producono gel, gomme e tyloses come mezzo per isolare diffusione patogeno (ad es McElrone et al 2008, 2010). Stress idrico può anche limitare il trasporto dell'acqua in xilema. Come piante perdono acqua durante la siccità prolungata, tensione cresce nei linfa xilema. L'acqua in tensione è metastabile (cioè ad una certa soglia la tensione diventa grande abbastanza per cavitazione colonne d'acqua contenuti in condotti xilematici). Dopo la cavitazione, una bolla di gas (embolia) può formare e riempire le condUIT, movimento dell'acqua bloccando (Tyree e Sperry 1989), un fenomeno analogo a malattia da decompressione (vale a dire "le curve") in palombari.
Nonostante l'importanza del trasporto xilematico acqua per la funzione ottimale delle piante, come dimostrato da un vasto corpo di letteratura storica e contemporanea su questo argomento (Tyree e Zimmermann, 2002. Holbrook et al, 2005), ci sono ancora aspetti di reti xilema che rimangono sfuggente . Diversi gruppi di ricerca hanno recentemente iniziato a utilizzare ad alta risoluzione x computerizzata a raggi micro-tomografia (HRCT) per valutare i dettagli più fini di anatomia in legno e tessuto vascolare (ad es Mayo et al, 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012A, b; Maeda e Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT è una tecnica non distruttiva utilizzata per visualizzare caratteristiche nell'interno di corpi solidi e di ottenere informazioni digitali sulle loro proprietà strutturali 3-D. HRTCdifferisce dal medico convenzionale CAT-scansione nella sua capacità di risolvere dettagli piccoli come un micron, anche per oggetti ad alta densità. I recenti progressi nella tecnologia di sincrotrone HRCT hanno migliorato la risoluzione delle immagini e rapporto segnale-rumore in modo sufficiente che le reti dei vasi di piante e le connessioni intervessel possono essere visualizzati, assegnato coordinate 3D, ed esportati per le simulazioni del modello idraulico. Brodersen et al. (2011) ha recentemente avanzato questa tecnica combinando ricostruzioni 3D generati dal sincrotrone HRCT con un modello Fortran che estrae automaticamente i dati dalla rete xilema con una risoluzione molto più alta di quanto sia mai stato possibile con i tradizionali metodi anatomici (di serie cioè sezionamento con un microtomo e l'acquisizione di immagini al microscopio ottico, ad esempio, Zimmermann 1971). Questo lavoro è stato utilizzato anche per ottimizzare i modelli idraulici del sistema xilema e identificato caratteristiche uniche di trasporto (flusso inverso cioè in qualche vessels durante i periodi di picco di traspirazione) (Lee et al., in revisione).
Sincrotrone HRCT può ora essere utilizzato per visualizzare le funzionalità dello xilema, suscettibilità alla cavitazione, e la capacità di alcune piante di assicurare la riparazione condotti embolizzato. La mancata ristabilire il flusso in condotti embolizzato riduce la capacità idraulica, la fotosintesi limiti, e si traduce in morte della pianta in casi estremi (McDowell et al. 2008). Le piante possono far fronte a emboli, deviando l'acqua intorno a blocchi tramite box di collegamento adiacenti condotti funzionali, e da una crescente xilema nuovo per sostituire perso capacità idraulica. Alcune piante hanno la capacità di riparare le fratture delle colonne d'acqua, ma i dettagli di questo processo in xilema sotto tensione sono rimasti poco chiari per decenni. Brodersen et al. (2010) ha recentemente visualizzato e quantificato il processo di ricarica in viti in diretta tramite HRCT. Nave di successo ricarica era dipendente afflusso acqua da cellule viventi che circonda la xylem condotti, in cui le gocce d'acqua individuali ampliato nel corso del tempo, i vasi pieni, e costretto la dissoluzione del gas intrappolato. La capacità di diverse piante per riparare vasi xilematici compromessi e dei meccanismi di controllo tali riparazioni sono attualmente in fase di studio.
Descrizione del meccanismo SLA beamline 8.3.2
Il nostro lavoro fino ad oggi è stato condotto sul Hard X-ray Micro-Tomografia Beamline 8.3.2 alla Fonte Advanced Light a Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Campioni vegetali sono posti in un piombo rivestito hutch situato a 20 metri dalla sorgente di raggi X, generato da un magnete 6 curva Tesla superconduttore dipolo all'interno Advanced Light Source operativo anello di accumulazione di elettroni con una energia critica di 11,5 KeV. Un schematico della stazione finale è mostrato in Figura 1. I raggi X inserire il hutch con un fascio di 40x ~ 4.6 mm e passare attraverso il campione che è montato su un palco rotante motorizzata. Iltrasmesso i raggi X incidono su un cristallo scintillatore (due materiali comunemente usati sono Luag CdWO o 4) che convertono i raggi X in luce visibile che viene trasmesso attraverso le lenti su un ccd per la raccolta di immagini. L', scintillatore telecamera e ottica sono contenuti in una scatola a tenuta di luce che è su rotaie che permettono il campione a distanza scintillatore essere ottimizzato per l'imaging a contrasto di fase.
Tutti i campioni sono montati sul stadio 10 cm di diametro rotante che a sua volta è montato su fasi di traslazione orizzontale e verticale per il posizionamento del campione. Un campione pianta vivente, con l'apparato radicale montato su un supporto personalizzato impianto costruito pentola e il fogliame contenuto in un tubo acrilico, può essere visto in Figura 2. Tempi di esposizione tipiche possono variare dal 0,1-1 sec utilizzando 10-18 KeV, e durate di scansione varierà 5-40 min a seconda delle impostazioni ottimizzate per un particolare campione. Per i campioni alti (tipico delle reti xilematico delle piante), le scansioni di dati possono esserepiastrelle ripetendo la misurazione con il campione a diverse altezze, che è controllata automaticamente, consentendo seamless sezioni seriali lungo un'altezza di campionamento massimo di circa 10 cm. Campione Larghezza massima quando l'imaging a 4.5 micron risoluzione è ~ 1 cm per i campioni che sono quasi perfetti in orientamento verticale. Generazione ed elaborazione dei dati viene completata usando il protocollo di seguito elencati. A causa della differenza di x-ray attenuazione tra aria e acqua, contrasto immagine eccellente può essere ottenuto in piante senza l'uso di soluzioni di contrasto tipici dei sistemi medicali CT. L'aria piena di lume del vaso è facilmente distinguibile dal circostante pieno d'acqua dei tessuti nelle piante idratati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synchotron HRCT fornisce biologi vegetali con un potente, non distruttivo strumento per esplorare i meccanismi interiori della vascolarizzazione pianta in dettaglio incredibile. Questa tecnologia è stata utilizzata di recente per identificare precedentemente non descritta strutture anatomiche in modo differenziato xilema vite che alterano la connettività di rete xilema in varie specie di vite (Brodersen et al 2012b, in corso di stampa.) – Questa connettività potrebbe alterare drasticamente la capaci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi, e A Zedan. Questo lavoro è stato finanziato da: il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti-Agricultural Research Service attuale sistema di finanziamento della ricerca dell'informazione (progetto di ricerca non 5306-21220-004-00; L'Advanced Light Source è supportato dal direttore, Office of Science, Ufficio di Basic. Scienze Energia, del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti nell'ambito del contratto n ° DE-AC02-05CH11231). NIFA sistemazioni e colture ricerca iniziativa sovvenzione AJM.
Materials
| Material Name/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
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