Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Summary

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Abstract

Ons begrip van de interactie van leukocyten en de vaatwand tijdens leukocyt capture wordt beperkt door een onvolledig begrip van de mechanische eigenschappen van het endotheeloppervlak laag. Het is bekend dat adhesiemoleculen op leukocyten zijn niet gelijkmatig ten opzichte oppervlaktopografie ³ verdeeld, dat topografie beperkt lijmverbinding formatie met andere oppervlakken ^9, en fysiologische contactkrachten (≈ 5,0 tot 10,0 per microvillus pN) kan de microvilli comprimeren als slechts een derde van hun lengte rusten, de toegankelijkheid van moleculen aan het tegenoverliggende oppervlak ^{3, 7.} We beschouwen het endotheel als een twee-lagen structuur, de betrekkelijk stijve cellichaam, plus de glycocalyx, een zachte beschermende suiker coating op het luminale oppervlak ^6. Het is aangetoond dat de glycocalyx kan fungeren als een barrière om de hechting van leukocyten verminderen aan het endotheliale oppervlak ^4.In dit rapport hebben we beginnen met de vervormbaarheid van endotheliale oppervlakken aan te pakken om te begrijpen hoe de endotheliale mechanische stijfheid kunnen bindingsvorming beïnvloeden. Endotheliale cellen gekweekt in statische cultuur spreken zich niet uit robuust glycocalyx, maar cellen gekweekt onder fysiologische stromingscondities beginnen een benadering van de glycocalyx waargenomen in vivo ^2. De modulus van de endotheelcellen lichaam is gemeten met behulp van atomic force microscopie (AFM) om ongeveer 5 tot 20 kPa ^5. De dikte en structuur van de glycocalyx werden bestudeerd met elektronenmicroscopie ⁸ en de modulus van de glycocalyx is benaderd door indirecte methoden, maar voor zover wij weten, zijn er geen gepubliceerde verslagen van een directe meting van de glycocalyx modulus in levende cellen . In deze studie presenteren we inkeping proeven met een nieuwe AFM probe op cellen die zijn gekweekt in omstandigheden hun glycocalyx expressie maximaliseren make directe metingen van de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx.

Protocol

1. Methoden 1,1 Cell Flow Kamer Een stromingskamer, getoond in figuur 1, is geconstrueerd dat cellen kunnen worden gekweekt onder een afschuifsnelheid van 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) en vervolgens direct overgebracht naar een Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). De stromingskamer werd voorbereid voor de proef door eerst reinigen van de glaasjes in Piranha-oplossing (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2)…

Representative Results

In een typisch experiment werden 20 kracht-vs-afstand curves verkregen uit een bepaald gebied van de cel, meestal in de perinucleaire regio dichtbij, maar niet op de kern (binnen ~ 2 pm). De krommen werden aangepast om eventuele drift monster gedurende de duur van de meting en vervolgens gemiddeld om cantilever ruis, zoals getoond in figuur 4. De curven werden geanalyseerd en passen de twee lagen model dat is ontwikkeld voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne polymeerfilms 1. Ui…

Discussion

We gebruikten waarden berekend uit de tweelagige model en Hertz theorie de interactie van leukocyten in het bloed aan de endotheel wand model. We hebben berekend dat een microvillus de leukocyten met een diameter van 50 nm minder dan 10 pN belasting zou ongeveer 150 nm streepje, in de glycocalyx, slechts een fractie van de totale dikte. Dit betekent dat de glycocalyx, met eigenschappen zoals gemeten in dit experiment, is een belangrijke belemmering voor cel-cel interactie en kan een grote sterische hindering die de cell…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
McCoy’s Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank’s Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652