पूर्व vivo पीएच biomacromolecular ड्रग्स साइटोसोलिक डिलिवरी के लिए उत्तरदायी Endosomolytic एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए लाल रक्त कोशिका hemolysis परख
Summary
एक hemolysis परख दवा वितरण प्रणाली और intracellular माल डिलीवरी लिए endosomolytic गतिविधि cytocompatibility की एक तेजी से, उच्च throughput स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. परख पर्यावरण पीएच के एक समारोह के रूप में एरिथ्रोसाइट झिल्ली के विघटन के उपाय.
Abstract
फॉस्फोलिपिड bilayers कि एंडो – lysosomal vesicles का गठन जीवविज्ञान दवाओं के intracellular लक्ष्य को प्रसव के लिए एक बाधा पैदा कर सकते हैं. इस बाधा को दूर करने के लिए, सिंथेटिक दवा वाहक के एक नंबर के लिए सक्रिय रूप से endosomal झिल्ली बाधित और cytoplasm में माल देने के लिए इंजीनियर किया गया है. यहाँ, हम hemolysis परख है, जो तेजी से, cytocompatibility और intracellular दवा वितरण प्रणाली के endosomolytic गतिविधि के लिए उच्च throughput स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन करता है.
Hemolysis परख में, मानव लाल रक्त कोशिकाओं और परीक्षण सामग्री परिभाषित PHS कि बाह्य है, जल्दी endosomal, और देर एंडो lysosomal वातावरण की नकल पर buffers में सह incubated. गोली बरकरार लाल रक्त कोशिकाओं को एक centrifugation कदम के बाद, हीमोग्लोबिन की मात्रा मध्यम में जारी spectrophotometrically (सबसे अच्छा गतिशील रेंज के लिए 405 एनएम) में मापा जाता है. प्रतिशत लाल रक्त कोशिका विघटन तो सकारात्मक नियंत्रण samp सापेक्ष मात्रा निर्धारित हैएक साबुन के साथ लेस lysed. इस मॉडल प्रणाली में एरिथ्रोसाइट झिल्ली लिपिड bilayer झिल्ली कि एंडो – lysosomal vesicles संलग्न करने के लिए एक किराए के रूप में कार्य करता है. वांछित परिणाम शारीरिक पीएच (7.4) और एंडो lysosomal लगभग 5-6.8 पीएच से पीएच रेंज में मजबूत hemolysis नगण्य hemolysis है.
Introduction
हालांकि वहाँ कई सेल के अंदर संभावित उच्च प्रभाव चिकित्सकीय लक्ष्य कर रहे हैं, एजेंटों के intracellular वितरण एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है. अक्सर, दवाओं, विशेष रूप से biologics, कोशिकाओं द्वारा भली भाँति हैं और vesicles में तस्करी कि या तो उनकी सामग्री की गिरावट एंडो – lysosomal मार्ग के माध्यम से करने के लिए नेतृत्व कर रहे हैं या वापस सेल के बाहर shuttled exocytosis के माध्यम से बाद की प्रक्रिया में, आंतरिक पीएच 1. vesicles के लगभग 5-6 acidified है, जो एंजाइमों की गतिविधि के लिए इष्टतम पीएच है कि इस डिब्बे में लाइसोजाइम के रूप में इस तरह के समारोह 2.
हाल ही में, सामग्री की संख्या विशेष रूप से किया गया है का लाभ उठाने के अम्लीकरण के लिए अपने माल की साइटोसोलिक वितरण की सुविधा endosomes इंजीनियर. इस दृष्टिकोण का एक उदाहरण सिंथेटिक बहुलक micelle नैनोकणों जिसका मुख्य शारीरिक पीएच (7.4) अर्थात् zwitterionic और आरोप तटस्थ है का उपयोग करता है. हालांकि, पीएच 6.0 पर- 6.5, पॉलिमर protonated हो जाते हैं और एक सकारात्मक चार्ज शुद्ध है कि micelle कोर destabilizes के अधिग्रहण, और उजागर बहुलक क्षेत्रों के साथ बातचीत और endosomal झिल्ली को बाधित. इस गतिविधि पेप्टाइड और न्यूक्लिक एसिड आधारित चिकित्सा विज्ञान की endosomal भागने को बढ़ावा देने के लिए, उन्हें अपने साइटोसोलिक लक्ष्य तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है के लिए दिखाया गया है endosomal भागने मध्यस्थता है कि झिल्ली बाधा को बाधित करने के लिए विकसित की विधियों की 3,4 अन्य उदाहरण है. 'Fusogenic' पेप्टाइड्स शामिल हैं या प्रोटीन है कि फॉस्फोलिपिड bilayer में झिल्ली संलयन या क्षणिक ताकना गठन मध्यस्थता कर सकते हैं. anionic (propylacrylic एसिड) पाली में alkyl एक्रिलिक एसिड की 5 homopolymers दूसरे दृष्टिकोण अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं, और इन पॉलिमर में, लटकन कार्बोक्जिलिक एसिड के protonation राज्य संक्रमण पैदा करती है एक hydrophobic में एंडो lysosomal पीएच पर्वतमाला में राज्य झिल्ली विघटनकारी 6,7.
स्क्रीनिंग endosomolytic व्यवहार के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली ई हैx vivo निर्भर पीएच hemolysis इस मॉडल प्रणाली में. परख 8, एरिथ्रोसाइट झिल्ली लिपिड bilayer झिल्ली कि एंडो – lysosomal vesicles संलग्न करने के लिए एक किराए के रूप में कार्य करता है. इस generalizable मॉडल दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स और अन्य polymeric जीन वितरण प्रणाली के endosomolytic व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रयोग में 8-11, मानव लाल रक्त कोशिकाओं और परीक्षा सामग्री buffers में परिभाषित PHS है कि नकल पर सह incubated कोशिकी (7.4), जल्दी (6.8), और endosomal एंडो lysosomal देर वातावरण (<6.8). ऊष्मायन अवधि के दौरान जारी हीमोग्लोबिन की मात्रा लाल रक्त सेल है, जो हीमोग्लोबिन की राशि एक साबुन के साथ सकारात्मक नियंत्रण lysed नमूनों में जारी करने के लिए normalized है की एक उपाय के रूप में मात्रा निर्धारित है.
स्क्रीनिंग से संभावित endosomolytic परीक्षण सामग्री का एक छोटा सा पुस्तकालय, एक कि नमूने है कि पीएच 7.4 में कोई hemolysis उत्पादन अनुमान कर सकते हैं, लेकिन काफी ऊंचा हेम<6.5 पीएच में olysis, साइटोसोलिक दवा वितरण के लिए सबसे प्रभावी और cytocompatible उम्मीदवार होगा. सामग्री है कि इन मानदंडों को फिट करने के लिए निष्क्रिय और अंधाधुंध एंडो lysosomal डिब्बों में internalization के बाद जब तक स्थानीय पीएच में एक बूंद के लिए उजागर झिल्ली bilayer लिपिड (यानी कि cytotoxicity का कारण बन सकता है) को नष्ट नहीं रहने की उम्मीद होगी.
इस प्रोटोकॉल में एरिथ्रोसाइट्स एक मानव दाता से अलग कर रहे हैं और पीएच 5.6, 6.2, 6.8, या 7.4 प्रयोगात्मक endosomolytic दवा वितरण एजेंटों के साथ सह incubated. बरकरार एरिथ्रोसाइट्स pelleted हैं, और supernatants (lysed एरिथ्रोसाइट्स से जारी हीमोग्लोबिन युक्त) हीमोग्लोबिन की विशेषता absorbance के लिए एक प्लेट पाठक (1 चित्रा) के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
पीएच उत्तरदायी पॉलिमर या अन्य एजेंट endosomolytic समारोह के लिए बनाया गया हो तेजी से और प्रभावी ढंग से पीएच endosome में सामना करना पड़ा मूल्यों में लाल रक्त कोशिकाओं की lysis (1 चित्र के आधार पर जांच कर सकते हैं, पी…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के रक्षा विभाग के माध्यम से Congressionally निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान (# W81XWH 10-1-+०,४४५) कार्यक्रम, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21 HL110056 NIH), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (11SDG4890030 #) धन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
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