Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs

Summary

Eine Hämolyse-Assay kann als schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Drug-Delivery-Systeme "cytocompatibility und endosomolytische Aktivität für die intrazelluläre Frachtlieferungen verwendet werden. Der Assay misst die Unterbrechung der Erythrozytenmembranen als Funktion der pH Wert.

Abstract

Phospholipiddoppelschichten die endo-lysosomalen Vesikeln bilden eine Barriere, die Lieferung von biologischen Medikamenten zur intrazellulären Ziele darstellen. Um diese Barriere zu überwinden, wurde eine Reihe von synthetischen Droge Trägern entwickelt worden, um aktiv zu stören den endosomalen Membran und liefern Fracht in das Zytoplasma. Hier beschreiben wir die Hämolyse Assay, der als rasche, Hochdurchsatz-Bildschirm für den cytocompatibility und endosomolytische Aktivität der intrazellulären Drug Delivery Systemen verwendet werden können.

In der Hämolyse Assay werden menschlichen roten Blutkörperchen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die extrazelluläre, frühe endosomalen und lysosomalen späten Endo-Umgebungen imitieren coinkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt zu pelletieren intakten roten Blutzellen, wird die Menge des Hämoglobins in das Medium freigesetzt spektrophotometrisch gemessen (405 nm für die besten Dynamikbereich). Der prozentuale Anteil der roten Blutkörperchen Störung wird dann quantifiziert, bezogen auf positive Kontrolle samples lysiert mit einem Reinigungsmittel. In diesem Modellsystem die Erythrozytenmembran dient als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Das gewünschte Ergebnis ist vernachlässigbar Hämolyse bei physiologischem pH (7,4) und robuste Hämolyse in der endo-lysosomalen pH-Bereich von etwa pH 5 bis 6,8.

Introduction

Obwohl es viele potenzielle high-impact therapeutische Ziele innerhalb der Zelle sind, stellt die intrazelluläre Abgabe von Mitteln eine große Herausforderung. Häufig werden Drogen, insbesondere Biologika, durch Zellen internalisiert und gehandelte zu Vesikeln, dass entweder eine Verschlechterung ihres Inhalts durch die Endo-lysosomalen Weg führen, oder zurück aus der Zelle über pendelte Exozytose. ¹ Bei letzterem Verfahren, das interne pH der Vesikel auf etwa 5-6 angesäuert, welches der optimale pH für die Aktivität von Enzymen, die Funktion in diesem Abteil, wie Lysozym. ²

In jüngster Zeit haben eine Reihe von Materialien speziell zu nutzen, die Versauerung der Endosomen, um cytosolische Lieferung von ihrer Ladung zu erleichtern entwickelt. Ein Beispiel für diesen Ansatz verwendet synthetische, Polymermizelle Nanopartikel, deren Kern im zwitterionischen und ladungsneutrale bei physiologischem pH (dh 7,4). Jedoch bei pH 6,0- 6.5, wobei die Polymere zu erwerben protoniert und eine positive Nettoladung, die die Micellkerns destabilisiert, und die freiliegenden Polymersegmente interagieren und stören die endosomale Membran. Diese Aktivität wurde gezeigt, dass die endosomalen Entweichen von Peptid und Nucleinsäure-Therapeutika zu fördern, so dass sie ihre Ziele cytosolischen übersetzen. ^3,4 Andere Beispiele von Methoden entwickelt, die den Escape-endosomalen Membranbarriere stören vermitteln beinhalten 'fusogenen' Peptide oder Proteine, die Membranfusion oder transiente Porenbildung in der Phospholipid-Doppelschicht vermitteln können. ⁵ Homopolymerisate von anionischen Alkylacrylsäuren wie Poly (Propylacrylsäure) sind eine weitere gut untersuchten Ansatz, und in diesen Polymeren, bestimmt der Protonierungsgrad von anhängenden Carbonsäure Übergangs in eine hydrophobe, Membran-disruptive Zustand in endo-lysosomalen pH-Bereiche. ^6,7

Ein nützliches Modell für das Screening endosomolytischen Verhalten ist die ex vivo pH-abhängig Hämolyse-Assay. ⁸ In diesem Modellsystem dient die Erythrozytenmembran als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht-Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Dieses Modell generalisierbar von anderen verwendet worden, um die endosomolytische Verhalten zellpenetrierendes Peptide und andere polymere Genabgabesysteme auszuwerten. ^8-11 In diesem Experiment sind menschliche rote Blutzellen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die imitieren coinkubiert extrazellulären (7,4), frühe Endosomen (6,8), und am späten endo-lysosomalen (<6,8) Umgebungen. Die Menge an Hämoglobin während der Inkubationszeit freigesetzt wird als Maß für die Lyse der roten Blutkörperchen, die der Menge an Hämoglobin im positiven Kontrollproben mit einem Detergens lysiert freigesetzt normalisiert wird quantifiziert.

Von Screening einer kleinen Bibliothek von potenziell endosomolytischen Testmaterialien, kann man folgern, dass Proben, die keine Hämolyse produzieren bei pH 7,4, aber deutlich erhöhten Saumolysis bei pH <6,5, werden die effektivsten und cytocompatible Kandidaten für cytosolische Drug Delivery sein. Materialien, die diese Kriterien erfüllen würde voraussichtlich nicht inert und nicht wahllos zerstören Lipiddoppelschichtmembranen (dh, die Zytotoxizität führen können) bis an einen Abfall der lokale pH-Wert nach Internalisierung in endo-lysosomaler Kompartimente ausgesetzt werden.

In diesem Protokoll werden Erythrozyten von einem menschlichen Spender isoliert und bei pH 5,6, 6,2, 6,8 oder 7,4 mit experimentellen endosomolytische Arzneimittelabgabe Mittel co-inkubiert. Intakte Erythrozyten werden pelletiert, und die Überstände (enthaltend Hämoglobin aus lysierten Erythrozyten freigesetzt) ​​für die charakteristische Absorption von Hämoglobin über einen Plattenleser (Abbildung 1) analysiert.

Protocol

Ein. Vorbereitung und Sterilisation von Puffer und Test-Agents 150 mM NaCl-Puffer: Man löst 4,383 g NaCl-Kristalle in 500 ml Nanopure-Wasser. pH-Puffer: Planen Phosphatpuffer bei pH 5,6, 6,2, 6,8 und 7,4 durch Mischen entsprechender Mengen an einbasischen und zweibasischen Natriumphosphat. Wenn Proben, bei niedrigeren pH-Werten (dh pH <5,6), dann eine mehr geeigneten Puffer, wie Citrat-Puffer getestet werden sollen, zu verwenden. Buffer Rezepte sind leicht zugänglich, und ein Beispiel …

Representative Results

Typischerweise weisen die Mittel, die idealen pH-abhängigen hämolytischen Verhalten zeigen das höchste Potenzial für cytosolische Abgabe von Medikamenten, Nukleinsäuren oder anderen bioaktiven Molekülen. Dies wird durch Agent # 1 beispielhaft dargestellt, wie in Abbildung 2, die minimale Hämolyse bei pH 7,4 zeigt dargestellt, aber ein starker Anstieg der hämolytischen Verhalten bei endosomalen pH-Bereichen (<6.5). Einige Mittel können ein erhebliches Maß an hämolytisch Verhalten bei …

Discussion

pH-empfindlichen Polymeren oder anderen Mitteln zur endosomolytischen Funktion konstruiert sein kann rasch und effektiv bezogen auf die Lyse der roten Blutzellen bei pH-Werten im Endosom angetroffen (Abbildung 1 gescreent; pH 6,8 – frühe Endosom, pH 6,2 – späte Endosom, pH 5,6 – Lysosom). ^14-17 pH-abhängigen Hämolyse wurde verwendet, um die Fähigkeit von Trägern zu endosomalen Freisetzung biomakromolekulare Therapeutika (z. B. Peptide, siRNA, ODNs, Proteine) vermitteln screenen…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes	Fisher Scientific	22-253-145	For blood collection
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge	Fisher Scientific	02-665-31	For blood collection
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	For blood collection
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	For blood collection
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	For blood collection
Hydrochloric acid (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	For adjustment of pH of D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positive control
Dulbecco’s PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-2C	For plate-reading at the end of the assay.
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-17	For incubation of red blood cells with experimental agents.