の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価
Summary
マイクロRNAは、脳の構造と機能に重要な役割を持っている。ここでは、設計されたmiRNAの発現レンチウイルスの定位注射を使用して過剰発現海馬のmiRNAを強制する方法について説明します。このアプローチは、評価するための比較的急速な方法として役立つことができる<em生体内で></em>特定の脳領域における過剰発現miRNAの効果。
Abstract
マイクロRNAは（miRNA）は長さ22ヌクレオチドの周りの小さな規制一本鎖RNA分子であるかもしれないことを各ターゲット多数のmRNA転写を誘導破壊および/またはこれらのターゲットの翻訳を阻害することによって薄暗い全体の遺伝子発現経路。いくつかのmiRNAは、神経構造と機能を維持するために、より高いレベルの脳機能において重要な役割を果たし、及び方法は、これらの機能を探索するためのそれらのレベルを操作するために求められている。ここでは、miRNAをコードするウイルス粒子の定位注射によってマウスにおける過剰な強制miRNAの認知影響を調べるためのインビボ方法で直接を提案する。具体的には、現在のプロトコルでは、海馬CA1哺乳類メモリの統合に貢献する地域、学習、ストレス応答への注入を含み、便利な注射部位を提供しています。座標は、デジタル制御と非常に遅い保持されるマウスブレグマとウイルス血流に従って測定される。注射後、手術創傷を密閉し、動物が回復される。対応するmRNAターゲットのサイレンサーをコードレンチウイルスはナイーブマウスに、生理食塩水及び対照として "空"のレンチウイルスベクターを注射したマウスに注射したマウスで、観察された効果に責任を特定のmiRNA /ターゲットの相互作用を巻き込むのに役立つ。一ヶ月後噴射は、動物はそれらのナビゲーション学習および記憶能力を評価するためのモリス水迷路（MWM）で検討されている。 MWMは1センチメートル水面下に沈んで小さなプラットフォームで着色水で満たされた丸いタンクである。タンクの周りに着実視覚的な手がかりは、空間ナビゲーション（音と地球の磁場にもナビゲートで動物を助けるかもしれない）を可能にします。ビデオカメラの監視は、水泳とプラットフォームを見つけ、量に時間の経路を測定することができます。マウスが最初に隠れたプラットフォームをマウントすると、強制水泳からの脱出を提供することを教えられて、それは、その後、このエスケープとfを使用するためにテストされinally、プラットフォームは削除され、マウスがその前の位置を記憶した場合のプローブテストは検討されています。複数の連続した日間のテストプラットフォームを見つけてマウントするために短い待ち時間で試験されたマウスのパフォーマンスの向上を強調し、より直接的なルートがプラットフォームまたはその場所に到達するまで繰り返される。このような改善を示すに失敗すると、その後（高架迷路内など ）は、特に試験することができる障害、学習と記憶、および/ または不安を表します。このアプローチは、研究、認知および/またはストレス関連のプロセス内の特定のmiRNAと標的転写物の検証を可能にします。
Introduction
神経系の機能の特定のmiRNAの役割は、最近いくつかの研究でレンチウイルス注射によって挑戦されています。 miRNAは、シナプス構造1、シナプス2およびシナプスの改造やメンテナンス3を維持し、再整形するために重要であることが見出されている。これらの研究は強くmiRNAはシェイプアップや神経系、認知機能の主な出力を維持するために両方で多値調節作用を介して、従事していることを示唆している。齧歯類の脳の特定の領域へのレンチウイルス粒子の定位注入はシナプスの形態と神経活動の変化を探し、そして過剰発現転写産物4,5の機能的意義を確立するために使用されたことができます。 miRNAの発現レンチウイルスと明確に定義された脳領域における神経細胞の直接感染は老化、脳障害や神経変性の研究に関与することができ、のmiRNA研究sが行動規制6-8の領域ではるかに高度な状 態にある、との定位注入のmiRNA発現行動テストに続いてレンチウイルス粒子は、そのような目的のために有用かもしれません。過剰または発現下誘導するためのかなり骨の折れる方法は、遺伝子組み換えノックインまたはノックアウトマウスが含まれます。遺伝システムは、さらに表現を条件と時間的制御を可能にすることができる（ 例えば、CRE-ロックス、テトシステム）が、これらはほとんど注射手順の空間的な特異性を提供していないし、漏出の一定量は、ほとんどの場合があります。また、エンジニアリングの手順は、手術を必要とせず、比較的良好な再現性を持つ研究室全体で使用できますが、彼らは遅くなりますとはるかに人材と財源を必要とする。また、過剰または注射したマウスで発現下の時間的制御は、遺伝子改変マウスに比べてはるかに正確です。
Protocol
Representative Results
Discussion
レンチウイルスの定位注入は、アップまたは異なる遺伝子やmiRNAのダウンレギュレーションの両方の生体内評価のための比較的迅速な方法である。主な選択肢ははるかに面倒で時間のかかる技法その後直接レンチウイルス注射である遺伝子組み換えマウスである。また、アップレギュレーションは、レンチウイルスの注射で、成体マウスで特定の時間に発生し、時間的制御を含?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、脳科学のためのエドモンドとリリー·サフラセンター（SBフェローシップ）、イスラエル科学財団（HSにグラント第11分の378、）と科学のためのドイツのイスラエル財団の遺産遺産バイオメディカル·サイエンス·パートナーシップ·プログラムによってサポートされています研究開発（GIF）（HSにグラント号1093-32.2/2010、）。
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
