Generasjon Stabile humane cellelinjer med Tetracycline-induserbar (Tet-on) shRNA eller cDNA Expression
Summary
En rask og enkel måte å generere humane cellelinjer med induserbar og reversible cDNA overekspresjon eller shRNA-mediert knock-ned av genet av interesse. Denne metoden gjør forskere til pålitelig og svært reproduserbart manipulere cellelinjer som er vanskelig å endre ved forbigående transfeksjon metoder eller konvensjonelle knockdown / knockout strategier.
Abstract
En stor tilnærming innen pattedyrcelle biologi er manipulering av ekspresjonen av gener av interesse i utvalgte cellelinjer, med sikte på å avsløre en eller flere av genets funksjon (er) ved hjelp av forbigående / stabil overekspresjon eller knockdown av genet av interesse. Dessverre, for ulike cellebiologiske undersøkelser denne tilnærmingen er uegnet når manipulasjoner av genuttrykk resultat i cellevekst / spredning feil eller uønsket celledifferensiering. Derfor har forskere tilpasset den Tetracycline repressor protein (TetR), tatt fra E. coli tetracyklin motstand 1 operon, for å generere svært effektiv og stram regelverk å uttrykke cDNA'ene i pattedyrceller 2,3. Kort sagt har TetR blitt modifisert til enten (1) blokk initiering av transkripsjon ved binding til Tet-operatøren (TO) i promoter-regionen ved tilsetning av tetracyklin (kalt Tet-off-system) eller (2) bindes til TO i than fravær av tetracyklin (kalt Tet-on-systemet) (Figur 1). Gitt ulemper Tet-off system krever kontinuerlig tilstedeværelse av tetracyklin (som har en halveringstid på omtrent 24 timer i vev cellekulturmedium) Tet-on-systemet har blitt mer omfattende optimalisert, som resulterer i utvikling av svært stramt og effektive vektor systemer for cDNA uttrykk som brukes her.
Kort tid etter etableringen av RNA-interferens (RNAi) for gene knockdown i pattedyrceller 4, vektorer som uttrykker korte hårnål RNA (shRNAs) ble beskrevet som fungerer svært lik siRNAs 5-11. Men disse shRNA-mediert knockdown tilnærminger har samme begrensning som konvensjonelle knockout strategier, siden stabil uttømming er ikke gjennomførbart når genet mål er avgjørende for cellulær overlevelse. For å overvinne denne begrensningen, van de Wetering et al. 12 endret shRNA ekspresjonsvektor pSUPER 5 </sup> ved å stikke en til i promoter-regionen, som gjorde dem i stand til å generere stabile cellelinjer med tetracyklin-induserbar uttømming av sine mål gener av interesse.
Her beskriver vi en fremgangsmåte til effektivt å generere stabile humant Tet-on cellelinjer som pålitelig kjøre enten induserbar overekspresjon eller uttømming av genet av interesse. Ved hjelp av denne metoden, har vi lykkes genereres Tet-on cellelinjer som i betydelig grad tilrettelagt analysen av MST / hMOB / NDR kaskade i sentrosomen 13,14 og apoptose signaliserer 15,16. I denne rapporten beskriver vi våre vektorer av valg, i tillegg til å beskrive de to etterfølgende manipulasjon trinnene som er nødvendige for å effektivt å generere human Tet-on cellelinjer (figur 2). Videre, i tillegg skissere en protokoll for generering av menneskelig Tet-on cellelinjer, vil vi diskutere viktige aspekter ved de tekniske prosedyrer og karakterisering av Tet-on celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi tror at Tet-on systemer sterkt lette analysen av genfunksjon, særlig i cellesystemer som er vanskelig å manipulere og / eller når den manipulerte genet er essensielt for celleoverlevelse. Videre tilbyr muligheten til å kontrollere genekspresjon ved svært spesifikke Tet-on systemer mulighet til å studere genfunksjoner på ulike stadier (for eksempel under cellesyklus progresjon eller veldefinerte differensiering prosesser). Metoden presenteres her at forskere å generere den ønskede stabile Tet-on cellelinjer i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer av vårt laboratorium for personer diskusjoner. Vi takker Joanna Lisztwan og Christina Gewinner for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av BBSRC tilskuddet BB/I021248/1 og Wellcome Trust stipend 090090/Z/09/ZAH er en Wellcome Trust Forskning Karriereutvikling stipendiat ved UCL Cancer Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
