وهناك طريقة سريعة وبسيطة لتوليد خطوط الخلايا البشرية مع محرض و overexpression [كدنا] أو عكسها shRNA بوساطة ضرب أسفل من الجينات في المصالح. هذه الطريقة تمكن الباحثين من خطوط الخلايا موثوق للغاية والتلاعب بتكاثر التي يصعب تغيير بالطرق التقليدية ترنسفكأيشن عابرة أو ضربة قاضية استراتيجيات / خروج المغلوب.
A نهج الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية الثديية هو التلاعب في التعبير عن الجينات ذات الأهمية في خطوط الخلايا المحددة، وذلك بهدف الكشف عن واحد أو عدة من وظيفة الجين (ق) باستخدام overexpression عابر / مستقر أو ضربة قاضية من الجين من الفائدة. للأسف، لإجراء تحقيقات الخلية البيولوجية المختلفة هذا النهج غير مناسب عندما تلاعب بنتيجة التعبير الجيني في النمو العيوب / تكاثر الخلايا غير المرغوب فيها أو تمايز الخلايا. ولذلك، تكيفت الباحثون بروتين التتراسيكلين كاظمة (TetR)، المأخوذ من E. القولونية المقاومة التتراسيكلين OPERON 1، لتوليد نظم تنظيمية فعالة جدا وضيقة للتعبير عن cDNAs في خلايا الثدييات 2،3. وباختصار، تم تعديل TetR لبدء إما كتلة (1) من النسخ عن طريق الربط إلى تيت-المشغل (TO) في منطقة المروج إضافة إلى التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت حالا النظام) أو ربط (2) إلى TO في رانه غياب التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت على نظام) (الشكل 1). نظرا للإزعاج أن النظام تيت لمرة ويتطلب استمرار وجود التتراسيكلين (التي لديها نصف عمر حوالي 24 ساعة في الخلية الأنسجة ثقافة المتوسط) وتيت على نظام تم على نطاق واسع أكثر الأمثل، مما أدى إلى تطوير ضيق جدا ونظم فعالة لمكافحة ناقلات التعبير كما هو مستخدم هنا [كدنا].
بعد وقت قصير من إنشاء تدخل الحمض النووي الريبي (رني) لضربة قاضية الجينات في خلايا الثدييات 4، معربا ناقلات قصيرة دبوس الشعر الرناوات (shRNAs) وصفت تلك الوظيفة مشابهة جدا لsiRNAs 5-11. ومع ذلك، هذه النهج ضربة قاضية shRNA بوساطة لها نفس القيد عن استراتيجيات خروج المغلوب التقليدية، منذ استنفاد مستقرة ليس ممكنا عندما الجينات الأهداف ضرورية لبقاء الخلوية. للتغلب على هذا القيد، فان دي Wetering وآخرون 12 تعديل التعبير shRNA ناقلات pSUPER 5 </suع> عن طريق إدراج TO في منطقة المروج، والذي مكنهم من توليد خطوط الخلايا مستقرة مع التتراسيكلين-محرض استنزاف الجينات المستهدفة اهتمامهم.
هنا، نحن تصف طريقة لتوليد بكفاءة مستقرة الإنسان تيت على خطوط الخلايا التي تدفع إما موثوق overexpression محرض أو استنزاف الجين في المصالح. باستخدام هذه الطريقة، ونحن قد ولدت بنجاح تيت على خطوط الخلايا التي سهلت كثيرا من تحليل سلسلة MST / hMOB / NDR في الجسيم المركزي 13،14 15،16 إشارة وموت الخلايا المبرمج. في هذا التقرير، ونحن لدينا وصف ناقلات الاختيار، بالإضافة إلى وصف خطوتين متتاليتين التلاعب والتي هي ضرورية لتوليد بكفاءة الإنسان تيت على خطوط الخلايا (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، إلى جانب وضع الخطوط العريضة لبروتوكول لتوليد تيت الإنسان على خطوط الخلايا، سوف نناقش الجوانب الحاسمة بشأن الإجراءات الفنية وتوصيف تيت على الخلايا.
نعتقد أن على أنظمة تيت يسهل إلى حد كبير في تحليل وظائف الجينات، ولا سيما في نظم الخلايا التي يصعب التلاعب و / أو عندما يكون الجين التلاعب أمر ضروري لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على التحكم في التعبير الجيني من قبل أنظمة تيت على محددة للغاية يتيح الفرصة لدراس…
The authors have nothing to disclose.
نشكر جميع أعضاء مختبرنا لإجراء مناقشات مفيدة. نشكر جوانا Lisztwan وGewinner كريستينا لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل BB/I021248/1 منحة BBSRC ويلكوم ترست منحة 090090/Z/09/ZAH هو البحث يلكوم ترست الوظيفي زميل التنمية في معهد السرطان UCL.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |