Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression
Summary
Eine schnelle und einfache Art und Weise die menschliche Zelllinien mit induzierbarer und reversible cDNA Überexpression oder shRNA-vermittelte Knock-down des Gens von Interesse zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, zuverlässig und hoch reproduzierbar zu manipulieren Zelllinien, die nur schwer durch transiente Transfektion Methoden oder konventionellen knockdown / Knockout-Strategien zu verändern sind.
Abstract
Ein wichtiger Ansatz im Bereich der Säugerzelle Biologie ist die Manipulation der die Expression von Genen von Interesse in ausgewählten Zellinien, mit dem Ziel, zu enthüllen einem oder mehreren der des Gens Funktion (en) unter Verwendung von transienten / stabile Überexpression oder Knockdown des Gens von Interesse. Leider für verschiedene zellbiologische Untersuchungen dieser Ansatz ist ungeeignet, wenn Manipulationen der Genexpression führen Zellwachstum / Zellproliferation Mängel oder unerwünschte Zelldifferenzierung. Daher haben Forscher die Tetracyclin-Repressorprotein (TetR), genommen aus dem E. angepaßt coli Tetracyclin-Resistenz-Operons 1, zu einer sehr effizienten und engen regulatorischen Systeme zu erzeugen, um cDNAs in Säugerzellen 2,3 auszudrücken. Kurz gesagt, hat TetR um entweder (1) Block Initiation der Transkription wurde durch Bindung an das Tet-Operator (TO) in der Promotorregion nach Zugabe von Tetracyclin (Tet-off bezeichnet System) oder (2) binden an die AN in modifizierter tEr Abwesenheit von Tetracyclin (sog. Tet-On-System) (Abbildung 1). Angesichts der Unannehmlichkeiten, das Tet-Off-System die kontinuierliche Anwesenheit von Tetracyclin (welches eine Halbwertszeit von etwa 24 Stunden in Gewebe Zellkulturmedium) erfordert das Tet-On-System wurden ausführlicher optimiert, was in der Entwicklung von sehr engen und effiziente Vektor-Systeme für die cDNA-Expression, wie hier verwendet.
Kurz nach der Gründung der RNA-Interferenz (RNAi) für die Gen-Knockdown in Säugetierzellen 4, Vektoren, kurz-hairpin RNAs (shRNAs) beschrieben wurden diese Funktion sehr ähnlich siRNAs 5-11. Jedoch haben diese shRNA-vermittelte Knockdown Ansätze die gleiche Einschränkung wie herkömmliche Knockout Strategien, da stabile Abreicherung nicht durchführbar, wenn Genziele für zelluläre Überleben essentiell. Um diese Einschränkung zu umgehen, van de Wetering et al. 12 veränderte die shRNA Expressionsvektor pSUPER 5 </sup> durch Einfügen eines TO in der Promotorregion, die sie zu stabilen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbare Depletion ihrer Zielgene von Interesse zu erzeugen aktiviert.
Hier beschreiben wir ein Verfahren effizient zu erzeugen stabilen menschlichen Tet-On Zell-Linien, die zuverlässig fahren entweder induzierbare Überexpression oder Abreicherung des Gens von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich generiert Tet-on-Zelllinien, die wesentlich erleichtert die Analyse der MST / hMOB / NDR Kaskade in Zentrosom 13,14 und Apoptose Signalisierung 15,16. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Vektoren der Wahl, neben der Beschreibung der zwei aufeinander folgenden Manipulationen Schritte, die erforderlich sind, um effizient zu erzeugen sind menschliche Tet-on-Zelllinien (Abbildung 2). Außerdem neben umreißt ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen Tet-On Zell-Linien werden wir kritischen Aspekte hinsichtlich der technischen Verfahren und die Charakterisierung von Tet-On-Zellen zu diskutieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir glauben, dass Tet-On-Systeme erheblich erleichtern die Analyse der Genfunktion, insbesondere in Zellsysteme, die schwierig zu manipulieren und / oder wenn die manipulierte Gen ist essentiell für das Überleben der Zelle sind. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, die Genexpression durch hochspezifische Tet-On-Systeme kontrollieren die Möglichkeit Genfunktionen in verschiedenen Phasen (zum Beispiel während der Zellzyklusprogression oder wohldefinierten Differenzierungsprozesse) studieren. Die hier vorgestellten V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors für hilfreiche Diskussionen. Wir danken Joanna Lisztwan und Christina Gewinner für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der BBSRC Gewährung BB/I021248/1 unterstützt und die Wellcome Trust Gewährung 090090/Z/09/ZAH ist ein Wellcome Trust Research Career Development Fellow an der UCL Cancer Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
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