A geração de linhas de células humanas estáveis com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA
Summary
Uma maneira rápida e simples para gerar linhas de células humanas com sobre-expressão de cDNA induzido e reversível ou shRNA mediada knock-down do gene de interesse. Este método permite aos investigadores linhas celulares de modo fiável e altamente reprodutível manipular que são difíceis de alterar pelos métodos de transfecção transiente ou convencionais knockdown / knockout estratégias.
Abstract
Uma abordagem importante no campo da biologia celular de mamífero é a manipulação da expressão de genes de interesse em linhas de células seleccionadas, com o objectivo de revelar uma ou várias das funções do gene (s), utilizando sobreexpressão transiente / estável ou knockdown do gene de interesse. Infelizmente, para investigações biológicas de células diferentes esta abordagem não é apropriada quando as manipulações de resultado da expressão do gene em células de crescimento / proliferação defeitos ou diferenciação celular indesejada. Por isso, os investigadores têm adaptado a proteína do repressor de tetraciclina (TetR), a partir da E. coli de resistência à tetraciclina do operão 1, para gerar muito eficientes e apertado sistemas reguladores para expressar cDNAs em células de mamíferos 2,3. Em suma, TetR foi modificado para a iniciação ou bloco (1) de transcrição ligando-se ao operador de Tet-(TO) na região promotora com a adição de tetraciclina (Tet-off denominado sistema) ou (2) se ligam ao A em tele ausência de tetraciclina (Tet-on denominado sistema) (Figura 1). Dado o inconveniente de que o sistema Tet-off é necessária a presença contínua de tetraciclina (que tem uma semi-vida de cerca de 24 h em meio de cultura de tecido de células) o Tet-on sistema tem sido mais extensivamente optimizada, resultando no desenvolvimento de muito apertado e sistemas de vectores para a expressão de cDNA eficientes como usado aqui.
Pouco tempo após o estabelecimento de interferência de RNA (RNAi) para knockdown do gene em células de mamíferos, quatro vectores que expressam hairpin RNAs curto (shRNAs) foram descritas em que a função muito semelhante ao siRNAs 5-11. No entanto, estas abordagens shRNA mediadas knockdown têm a mesma limitação quanto knockout estratégias convencionais, uma vez que a depleção estável não é exequível quando genes alvos são essenciais para a sobrevivência celular. Para superar essa limitação, van Wetering de et al. 12 modificou a expressão shRNA vetor pSUPER 5 </sup>, inserindo um TO na região do promotor, o que lhes permitiu gerar linhas celulares estáveis com tetraciclina induzível por depleção dos seus genes-alvo de interesse.
Aqui, nós descrevemos um método para gerar eficientemente estável humano Tet-on linhas celulares que conduzem fiável ou sobre-expressão induzível ou depleção do gene de interesse. Usando este método, têm gerado com êxito Tet-em linhas de células que facilitou significativamente a análise da cascata de MST / hMOB / NDR centrossoma em 13,14 e 15,16 sinalização da apoptose. Neste relatório, descreve-nossos vectores de escolha, para além de descrever as duas etapas consecutivas de manipulação que são necessários para gerar de forma eficiente humano-Tet em linhas de células (Figura 2). Além disso, além de traçar um protocolo para a geração de Tet-humana em linhas de células, vamos discutir os aspectos críticos sobre os procedimentos técnicos e caracterização de Tet-nas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cremos que os sistemas de Tet-on facilitar grandemente a análise da função dos genes, em particular em sistemas de células que são difíceis de manipular e / ou quando o gene manipulado é essencial para a sobrevivência da célula. Além disso, a capacidade de controlar a expressão de genes específicos por altamente Tet-em sistemas oferece a oportunidade de estudar funções de genes em estágios diferentes (por exemplo, durante a progressão do ciclo celular ou processos bem definidos de diferenciação). O mé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros de nosso laboratório para discussões úteis. Agradecemos Joanna Lisztwan e Christina Gewinner para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela concessão BBSRC BB/I021248/1 e do Wellcome Trust concessão 090090/Z/09/ZAH é um Wellcome Research Trust companheiro de Desenvolvimento de Carreira no Câncer UCL Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
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