Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA
Summary
Una manera rápida y sencilla para generar líneas celulares humanas con sobreexpresión inducible y reversible de ADNc o shRNA mediada derribar-del gen de interés. Este método permite a los investigadores a las líneas celulares altamente fiable y reproducible manipular que son difíciles de modificar por métodos de transfección transitoria o estrategias convencionales desmontables / knockout.
Abstract
Un enfoque importante en el campo de la biología de células de mamíferos es la manipulación de la expresión de genes de interés en líneas celulares seleccionadas, con el fin de revelar una o varias de la función del gen (s) mediante la sobreexpresión transitoria / estable o caída del gen de interés. Desafortunadamente, para las investigaciones de células biológicas diferentes este enfoque no es adecuado cuando las manipulaciones del resultado de la expresión génica en células de crecimiento / proliferación de defectos o la diferenciación celular, no deseada. Por lo tanto, los investigadores han adaptado la proteína represora de tetraciclina (TetR), tomada de la E. coli resistencia a la tetraciclina operón 1, para generar sistemas de regulación eficientes y muy estrecho para expresar ADNc en células de mamífero 2,3. En resumen, TetR se ha modificado para cualquiera de iniciación bloque (1) de la transcripción mediante la unión al operador Tet-(A) en la región del promotor tras la adición de tetraciclina (Tet-off denomina sistema) o bind (2) a la A en tél ausencia de tetraciclina (Tet-on denomina sistema) (Figura 1). Teniendo en cuenta el inconveniente de que el sistema Tet-off requiere la presencia continua de tetraciclina (que tiene una vida media de aproximadamente 24 horas en medio de cultivo de tejido de células) el sistema Tet-on ha sido más ampliamente optimizada, lo que resulta en el desarrollo de muy apretado y sistemas eficientes de vector para la expresión de ADNc tal como se usa aquí.
Poco después del establecimiento de la interferencia de ARN (RNAi) para knockdown gen en células de mamífero 4, vectores que expresan corto horquilla RNAs (shRNAs) se describe que la función muy similar a siRNAs 5-11. Sin embargo, estos enfoques shRNA mediada desmontables tienen la misma limitación como estrategias knockout convencionales, ya que el agotamiento estable no es factible cuando los objetivos de genes son esenciales para la supervivencia celular. Para superar esta limitación, van de Wetering et al. 12 modificó la expresión shRNA vector pSUPER 5 </sup> mediante la inserción de una A en la región promotora, lo que les permitió generar líneas celulares estables con depleción inducible por tetraciclina de sus genes diana de interés.
Aquí se describe un método para generar eficientemente humano estable Tet-en líneas celulares que conducen fiable sobreexpresión inducible o el agotamiento del gen de interés. Usando este método, se han generado con éxito Tet-en líneas celulares que facilita considerablemente el análisis de la cascada de MST / hMOB / NDR en centrosoma 13,14 y 15,16 apoptosis de señalización. En este reporte se describe nuestros vectores de elección, además de describir los dos pasos consecutivos de manipulación que son necesarios para generar eficientemente humano Tet-en líneas celulares (Figura 2). Por otra parte, además de plantear un protocolo para la generación de recursos humanos Tet-en líneas celulares, vamos a discutir los aspectos críticos relacionados con los procedimientos técnicos y la caracterización de Tet-en las células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Creemos que Tet-On sistemas facilitan en gran medida el análisis de la función génica, particularmente en sistemas de células que son difíciles de manipular y / o cuando el gen manipulado es esencial para la supervivencia celular. Además, la capacidad de controlar la expresión de genes altamente específicos por Tet-On sistemas ofrece la oportunidad de estudiar las funciones de genes en diferentes etapas (por ejemplo durante la progresión del ciclo celular o bien definidos los procesos de diferenciación). El m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a todos los miembros de nuestro laboratorio útil para los debates. Damos las gracias a Joanna Lisztwan y Gewinner Christina para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el BBSRC BB/I021248/1 subvención y el Wellcome Trust subvención 090090/Z/09/ZAH es un Wellcome Research Trust Carrera compañero de Desarrollo en el Instituto UCL Cancer.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
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