Generering av stabila humana cellinjer med tetracyklin-inducerbar (Tet-on) shRNA eller cDNA-uttryck
Summary
En snabb och enkelt sätt att skapa humana cellinjer med inducerbar och reversibla cDNA överuttryck eller shRNA-medierad knock-down av genen av intresse. Denna metod gör det möjligt för forskare att tillförlitligt och mycket reproducerbart manipulera cellinjer som är svåra att förändra genom transient transfektion metoder eller konventionella knockdown / knockout strategier.
Abstract
En viktig metod inom området för däggdjurs cellbiologi är manipulation av uttrycket av gener av intresse i utvalda cellinjer, i syfte att avslöja ett eller flera av genens funktion (er) med användning av övergående / stabil överexpression eller ÖVERVÄLDIGANDE av genen av intresse. Tyvärr, för olika cellbiologiska undersökningar detta tillvägagångssätt är olämpligt när manipulationer av genuttryck resulterar i celltillväxt / spridning fel eller oönskad celldifferentiering. Därför har forskare anpassat Tetracyklin repressorprotein (TetR), som tagits från E. E. coli tetracyklinresistens operonet 1, för att generera mycket effektiva och tät regelsystem för att uttrycka cDNA i däggdjursceller 2,3. I korthet har TetR ändrats till antingen (1) blockera initiering av transkription genom bindning till Tet-operatören (TO) i promotorregionen vid tillsats av tetracyklin (benämnd Tet-off system) eller (2) binder till TO i tHan frånvaro av tetracyklin (kallas Tet-on-system) (figur 1). Med tanke på olägenheten att Tet-off system kräver kontinuerlig närvaro av tetracyklin (som har en halveringstid av ca 24 timmar i vävnadskultur cellodlingsmedium) Tet-på systemet har mer utförligt optimerats, vilket resulterar i utvecklingen av mycket snäva och effektiva vektorsystem för cDNA-uttryck som används här.
Strax efter inrättandet av RNA-interferens (RNAi) för gen ÖVERVÄLDIGANDE i däggdjursceller 4, vektorer som uttrycker korta hårnål RNA (shRNAs) beskrevs som fungerar mycket likt siRNA 5-11. Dessa shRNA-medierade knockdown metoder har samma begränsning som konventionella knockout strategier, eftersom en stabil utarmning är inte möjligt när genen mål är avgörande för cellulär överlevnad. För att övervinna denna begränsning, van de Wetering et al. 12 ändrade shRNA expressionsvektorn pSUPER 5 </sup> genom att sätta en i promotorregionen, som möjligt för dem att generera stabila cellinjer med tetracyklin-inducerbar utarmning av deras målgener av intresse.
Här beskriver vi en metod för att effektivt generera en stabil human Tet-på cellinjer som tillförlitligt driver antingen inducerbar överuttryck eller utarmning av genen av intresse. Med denna metod har vi genererat framgång Tet-on cellinjer som avsevärt underlättade analysen av MST / hMOB / NDR kaskad i centrosome 13,14 och apoptos signalering 15,16. I denna rapport beskriver vi våra vektorer av val, förutom att beskriva de två på varandra följande manipulation steg som krävs för att effektivt generera mänskligt Tet-on cellinjer (Figur 2). Dessutom, förutom beskriver ett protokoll för generering av humana Tet-on cellinjer kommer vi att diskutera kritiska aspekter avseende de tekniska förfaranden och karakterisering av Tet-på celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi tror att Tet-on system i hög grad underlätta analysen av genfunktion, särskilt i cellsystem som är svåra att manipulera och / eller när den manipulerade genen är väsentlig för cellöverlevnad. Dessutom erbjuder möjligheten att kontrollera genuttryck genom högspecifika Tet-on system möjlighet att studera genfunktioner på olika stadier (t.ex. under cellcykelns framskridande eller väldefinierade differentieringsprocesser). Den metod som presenteras här gör det möjligt för forskare att generera den öns…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla medlemmar i vårt laboratorium för hjälp diskussioner. Vi tackar Joanna Lisztwan och Christina Gewinner för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av BBSRC bidraget BB/I021248/1 och Wellcome Trust bidraget 090090/Z/09/ZAH är en Wellcome Trust Research Career Development fellow vid UCL Cancer Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
