テトラサイクリン誘導性（テトオン）shRNAまたはcDNA発現で安定ヒト細胞株の世代
Summary
誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。
Abstract
哺乳類の細胞生物学の分野での主要なアプローチは、遺伝子の安定/一過性過剰発現またはノックダウンを使用して、1つ以上の遺伝子の機能のいくつか（複数可）を明らかにする目的で、選択された細胞株において、目的の遺伝子の発現の操作です興味のある。残念なことに、様々な細胞生物学的研究のためにこのアプローチは、細胞の成長/増殖欠陥や不要な細胞分化における遺伝子発現結果の不適切な操作です。したがって、研究者は、 大腸菌から取らテトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetRを）、適応している大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロン1、2,3、哺乳動物細胞でのcDNAを表現するために非常に効率的かつタイトな規制制度を生成する。要するに、TetRをINにするテトラサイクリン（Tet-オフシステムと呼ばれる）を添加した際のプロモーター領域におけるテト – オペレーター（TO）に結合すること、または（2）に結合することにより転写のブロック（1）開始のいずれかに変更されましたトンテトラサイクリンの彼が不在（システムテトオンと呼ばれる）（ 図1）。テトオフシステムは非常にタイトなの開発で、その結果、テトラサイクリンの連続的な存在（組織細胞培養培地中で約24時間の半減期を持っている）テトオンシステムがより広範囲に最適化されているが必要であることを不便与えとcDNA発現のための効率的なベクター系は、ここで使用される。
まもなく、哺乳動物細胞における4遺伝子ノックダウンのためのRNA干渉（RNAi）の設立後、ショートヘアピンRNA（shRNA）を発現ベクターは、siRNAは5月11日と非常によく似て、その関数を記述した。遺伝子標的は、細胞の生存に必須であるときに安定枯渇が現実的ではありませんので、しかし、これらのshRNAによるノックダウンのアプローチは、従来のノックアウト戦略と同じ制限があります。この制限を克服するために、バン·デ·ウェテリンクらは12のshRNA発現ベクターpSUPER 5変更 </suP>彼らが興味のある標的遺伝子のテトラサイクリン誘導性の枯渇との安定した細胞株を生成する場合に有効にプロモーター領域、INに挿入することによって。
ここでは、効率的に安定した人間テトオンを生成するために、確実に目的の遺伝子の過剰発現誘導または枯渇のどちらかを駆動する細胞株の方法を説明します。この方法を使用すると、我々は正常に生成したテトオン著しく中心体13,14と15,16シグナリングアポトーシスのMST / hMOB / NDRカスケードの解析を容易にした細胞株。本稿では、選択した私たちのベクトルを記述し、効率的に生成するために必要な2つの連続した操作手順を記述することに加えて、人間テトオン細胞株（ 図2）。さらに、ヒトテトオン細胞株を樹立するためのプロトコルを概説に加えて、我々は技術的な手順およびTet-上の細胞の特性に関する重要な側面について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々はテトオンシステムが大幅に特に操作遺伝子は細胞の生存に必須であるときに操作および/またはすることが困難である細胞系において、遺伝子機能の解析を容易にすると信じています。さらに、高度に特異的なテトオンシステムによって遺伝子発現を制御する能力は、様々な段階（細胞周期の進行や、明確に定義された分化プロセス中など）で遺伝子の機能を研究する機会を提供してい…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は有用な議論のために、我々の研究室のすべてのメンバーに感謝。我々は、原稿の読み取りのために重要なジョアンナLisztwanとクリスティーナGewinnerに感謝します。この作品は、BBSRC助成BB/I021248/1とウェルカムトラスト助成090090/Z/09/ZAHによってサポートされていましたUCLのがん研究所でウェルカムトラスト·リサーチ·キャリア開発仲間です。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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