（TET-ON）与四环素诱导shRNA或cDNA表达生成稳定的人类细胞系
Summary
一种快速简便的方法来产生人类细胞系诱导的，可逆的基因表达或shRNA介导的，感兴趣的基因敲除。此方法使研究人员能够可靠地和高再现性操作的细胞系，是很难改变，通过瞬时转染的方法或常规的击倒/基因敲除策略。
Abstract
一个主要的方法在哺乳动物细胞生物学领域是操纵在选定的单元格线的兴趣基因的表达，的目的是显示一个或多个该基因的功能（次）瞬态/稳定过表达或敲除的基因的兴趣。不幸的是，这种做法是不合适的各种细胞生物学研究时，操纵细胞的生长/的增殖缺陷或不需要的细胞分化的基因表达的结果。因此，研究人员已经适应了四环素阻遏蛋白（四环素），采取从E.大肠杆菌四环素抗性操纵子1，生成非常高效和严格的监管系统，以表达在哺乳动物细胞中的cDNA 2,3。总之，四环素 – 已被修改，或者（1）块转录起始的绑定到在Tet-运算符（TO）的启动子区域中添加四环素（称为Tet-off系统）时，或（2）结合的TO在吨他没有四环素（称为的Tet-系统）（ 图1）。鉴于不便Tet-off系统需要四环素（它具有的半衰期为约24小时，在组织细胞培养基）的持续存在的Tet-系统上的已被更广泛地优化，在很紧的发展所导致的和高效的cDNA表达载体系统，在这里使用。
成立后不久的RNA干扰（RNAi）的基因敲除在哺乳动物细胞中，载体表达的短发夹RNA（shRNA片段）进行了描述，非常到的siRNA 5-11类似的功能。然而，这些shRNA介导的敲除的方法具有相同的限制，与传统的基因敲除策略，当靶基因的细胞存活是必不可少的，因为稳定的消耗是不可行的。为了克服这种局限性，面包车韦特灵等 12修改的shRNA表达载体pSUPER 5 </su对>通过插入一个TO中的启动子区域，使他们能够产生稳定的细胞系与四环素诱导耗尽其感兴趣的靶基因。
在这里，我们描述了一个方法，有效地生成稳定的人的春节，可靠地驱动“诱导表达或枯竭，感兴趣的基因的细胞株。使用这种方法，我们已经成功生成春节细胞株，大大促进了分析的的MST / hMOB / NDR级联中心体13,14和凋亡信号15,16。在此报告中，我们描述我们给出的载体，除了描述的两个连续的操作步骤是必要的以有效地产生人的Tet-细胞系（ 图2）。此外，除了概述的产生的一个协议，用于人类的Tet-细胞系中，我们将讨论有关的技术程序和表征的Tet-细胞上的关键方面。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们相信的Tet-系统上，大大方便了对基因功能的分析，特别是在电池系统是难以操纵和/或当操纵基因的细胞的存活是必需的。此外，能够控制基因的表达具有高度特异性春节的系统上提供了一个机会来研究基因功能，在不同的阶段（例如在细胞周期进展或明确定义的分化过程）。这里介绍的方法使研究人员能够生成所需的稳定的Tet-细胞株在合理的时间内（一般为3-6个月，很大程度上取决于四环?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢我们实验室的所有成员的有益讨论。我们感谢的乔安娜Lisztwan和克里斯蒂娜Gewinner批判性阅读的手稿。本工作受的BBSRC授予BB/I021248/1和威康信托基金会资助090090/Z/09/ZAH是一个威康信托基金会的研究生涯发展的伦敦大学学院癌症研究所的研究员。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
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