Occlusion 2 Navire / Hypotension: un modèle de rat d'ischémie cérébrale globale

Summary

Occlusion carotidienne bilatérale associée à une hypotension systémique produit ischémie globale du cerveau chez le rat, causant des dommages à l'hippocampe avec sévérité reproductible. sujets animaux sont altérées avec des modèles prévisibles de lésions cérébrales, ils récupèrent opportunément, et les taux de mortalité sont relativement faibles.

Abstract

L'arrêt cardiaque suivi d'une réanimation se traduit souvent par des dommages au cerveau dramatique causée par l'ischémie et la reperfusion subséquente du cerveau. Ischémie globale du cerveau produit des dommages à des régions spécifiques du cerveau révélés être très sensible à l'ischémie ^1. Neurones de l'hippocampe ont une plus grande sensibilité aux agressions ischémiques par rapport à d'autres populations de cellules, et en particulier, la région CA1 de l'hippocampe est particulièrement vulnérable à l'ischémie / reperfusion ^2.

La conception des interventions thérapeutiques, ou l'étude des mécanismes impliqués dans la lésion cérébrale, nécessite un modèle qui produit des dommages semblables à l'état clinique et de façon reproductible. Occlusion du vaisseau carotide bilatérale avec hypotension (2VOH) est un modèle qui produit une ischémie du cerveau antérieur réversible, imitant les événements cérébraux qui peuvent survenir lors de l'arrestation et de réanimation cardiaque. Nous décrivons un modèle modifié de Smith et al. (1984) ², En tant que premier présenté sous sa forme actuelle en ³ Sanderson et al. (2008), qui produit des blessures reproductible sélectivement les régions du cerveau vulnérables ^3-6. La fiabilité de ce modèle est dicté par un contrôle précis de la pression artérielle systémique pendant hypotension appliquée, la durée de l'ischémie, un contrôle étroit de la température, un régime d'anesthésie spécifique, et diligent soins post-opératoires. Un accident ischémique 8 minutes produit la mort cellulaire des neurones CA1 hippocampique qui progresse au cours de 6 à 24 heures de reperfusion, tandis que les régions du cerveau les moins vulnérables sont épargnés. Cette mort cellulaire progressive est facilement quantifiable après 7-14 jours de reperfusion, comme une perte presque complète des neurones CA1 est évident en ce moment.

En plus de ce modèle de lésion cérébrale, nous présentons une méthode de quantification des dommages CA1 l'aide d'un simple, mais complète, de la méthodologie. Surtout, la quantification peut être réalisée à l'aide d'un simple microscope caméra montée, unda gratuit ImageJ (NIH) plugin, éliminant ainsi la nécessité pour les logiciels stéréologie coûts prohibitifs et une scène microscopique motorisé pour l'évaluation des dommages.

Introduction

Les lésions cérébrales à la suite d'une arrestation et d'AVC cardiaque est une cause majeure de décès et d'invalidité à long terme. Alors que la réanimation cardiorespiratoire pour les victimes d'un arrêt cardiaque réussit à rétablir la circulation spontanée dans environ 70.000 patients par an aux Etats-Unis ^7,8 au moins 60% de ces patients décèdent par la suite à l'hôpital à la suite d'importants dommages au cerveau et seulement 3-10% des patients réanimés peuvent reprendre leurs anciens modes de vie ^9,10. De toute évidence, la compréhension des mécanismes qui conduisent à des lésions cérébrales suite à une ischémie globale du cerveau et de concevoir des interventions thérapeutiques visant à minimiser le traumatisme neurologique est d'une importance critique.

ischémie cérébrale peut être modélisée en utilisant plusieurs méthodes. Le plus souvent, l'ischémie cérébrale est produite chez le rongeur par occlusion d'un vaisseau sanguin dans le cerveau, l'artère cérébrale moyenne, produisant ainsi un accident vasculaire cérébral ischémique focal ^11,12. Bien que cliniquement importante,ischémie cérébrale focale n'est pas une méthode précise pour étudier les lésions cérébrales produites par arrêt / réanimation cardiaque. Pour modéliser ce paradigme clinique le cerveau entier doit être effectué ischémique suivie par la réintroduction du flux sanguin. Pour imiter étroitement cette présentation clinique, les chercheurs induisent expérimentalement arrêt cardiaque suivi d'une réanimation avec RCR et la défibrillation ^13,14. Ce modèle est cliniquement pertinente, les temps de réanimation cependant imprévisibles peuvent augmenter la variabilité et peuvent faire l'analyse des données difficiles à interpréter. En outre, ce modèle est associé à un taux de mortalité élevé, augmentant encore nombre d'animaux nécessaires pour tester une hypothèse. Etude de la réponse cérébrale à une ischémie globale et / ou de reperfusion dans une insulte plus reproductible, cohérente et survivre peut être préféré.

Ischémie globale peut être induite dans le cerveau, tout en préservant une certaine circulation sanguine systémique. Cela permet de réduire la mortalité, tout en permettant investigation des mécanismes de lésions tissulaires dans le cerveau ^2. Pour produire une ischémie globale du cerveau, il est nécessaire d'interrompre ou de limiter considérablement l'écoulement dans les quatre vaisseaux qui irriguent le cerveau, les artères carotides internes et les artères vertébrales. Ces navires alimentent le cerveau avec le flux sanguin à travers une structure vasculaire appelé le Cercle de Willis, qui forme une boucle anastomotique. Cette architecture permet vasculaire du cerveau à retenir perfusion en cas d'occlusion vasculaire proximale. Par conséquent, pour induire une ischémie complète du cerveau, le flux sanguin à travers tous les navires de cotisation doit se produire. Carotide occlusion peut être accompli en utilisant un cou ventral minimalement invasive coupe-bas et l'application de clips anévrisme pendant une période désirée. Interruption de la circulation sanguine à travers les artères vertébrales peut être difficile, car ils sont incased dans les trous transversale de la colonne vertébrale. Les enquêteurs se sont penchés sur cette electrocauterizing par les artères vertébrales 24-48 heures avant carotideocclusion et l'ischémie cérébrale (4VO modèle) ^15. Contrairement à cette approche, Smith et al. Développé une méthode pour induire une ischémie globale du cerveau en réduisant signifie la pression artérielle (MAP) systémique à 40 mmHg pour réduire perfusion à travers les artères vertébrales à un point où le débit sanguin est perdue ou fortement réduit ² . Lorsqu'il est couplé avec l'occlusion carotidienne, cette méthode produit tout au long de l'ischémie du cerveau antérieur, résultant en un modèle de lésion cérébrale qui imite étroitement que des survivants d'arrêt cardiaque. Dans un autre raffinement de cette méthode, le modèle que nous présentons ici nécessite une réglementation MAP serré à 30 mmHg ± 1mHg pendant toute la 8 min d'ischémie. Nous avons trouvé cette modification améliore la reproductibilité des lésions cérébrales induites par ce modèle tout en préservant le faible taux de mortalité de la technique originale conçue par Smith et al.

Le phénotype précise de la mort cellulaire et de l'étendue globale de dommages aux tissus causés parLe modèle présenté ici est directement dépendante de la durée ischémique ^16. Après 8 minutes d'ischémie, neurones CA1 présentent des retardé la mort cellulaire, suggérant qu'il existe une fenêtre temporelle pour l'intervention thérapeutique au cours de la phase de reperfusion ^15,17. Au début de la reperfusion, les neurones retrouver rapidement la fonction et pas de mort cellulaire immédiate est détectable ^18. Cependant, cette insulte provoque l'induction de cascades de mort cellulaire (apoptose) qui aboutissent à la libération de protéines apoptogènes des mitochondries, y compris cytochrome c, entre 4-6 heures de reperfusion ^3,19. Entre 6 et 24 heures de reperfusion, les neurones de l'hippocampe CA1 se sont engagés à mort de la cellule, et le programme de mort cellulaire par apoptose est exécutée ^19. Il convient de noter que le phénotype de mort cellulaire responsable de la lésion ischémique est très controversée. Les premières études ont suggéré nécrose est la principale phénotype de mort cellulaire ^20,21, tandis que d'autres d'autres rapportent apoptosis comme le principal mécanisme de ^22,23. Au total, les données actuelles suggèrent que les cellules meurent d'un spectre de phénotypes de mort cellulaire allant de l'apoptose classique à la nécrose. Le mode précis de la mort cellulaire dépend de nombreux facteurs, avec le degré de contribution de chaque phénotype en fonction de la gravité de l'insulte, parmi d'autres facteurs ^24,25. En 24 heures de reperfusion, les cellules meurent possèdent noyaux pycnotiques, cytosol condensée avec une preuve claire de contenus cellulaires globales, et la perte de la morphologie mitochondriale fonctionnel. Les cellules mortes sont ventilés, engloutis par les cellules immunitaires comme les macrophages et / ou de la microglie, et effacées de la région hippocampique CA1. En 4-7 jours de reperfusion, les cellules mortes sont éliminées, et tout ce qui reste sont des cellules inflammatoires et les cellules gliales activées ^17,26. Par conséquent, les 7 jours de reperfusion représente un moment optimal où CA1 mort neuronale hippocampique peut être quantifiée en utilisant des taches de cellules simples, non spécifiques, eny compris Le violet de crésyl ou hématoxyline-éosine et comptés sur la base de critères d'inclusion morphologiques. Les cellules restantes à cet intervalle de reperfusion tardive peuvent être considérés comme des cellules survivantes, fournissant ainsi un indice de lésions cérébrales.

Si ce modèle doit être utilisé pour tester des interventions thérapeutiques, il est suggéré que le protocole expérimental suivi des critères d'escalier (Stroke Therapy Industrie Académique Table ronde) ^27. Ces directives doivent être suivies lors de la conception et la réalisation d'une étude, mais ne sont pas discutés ici.

Protocol

1. Préparation Tous les expérimentations animales doivent être conformes aux directives institutionnelles et obtenir une approbation par un comité respectif de protection des animaux avant l'initiation. Toutes les procédures présentées ici ont été approuvés par la Wayne State University Institutional Animal Care et utiliser Comité et suivre les lignes directrices sur le traitement éthique des animaux mis en avant dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de la…

Representative Results

Le modèle 2VOH d'ischémie / reperfusion cérébrale globale provoque la mort des neurones dans la région CA1 de l'hippocampe. Figure 2 représente la blessure produite par 8 min d'ischémie globale du cerveau, traitement 14 jours après la reperfusion. Figures 2A et 2B comparer les hippocampes d'imposture et cerveaux post-ischémiques, colorées avec du violet de crésyl. Figure 2a montre un hippocampe d'un rat opération fictive …

Discussion

Le modèle décrit ici produit un accident ischémique dans le cerveau qui peuvent survenir à la suite de l'arrestation et de réanimation cardiaque, fournissant une blessure similaire à celle trouvée chez l'homme. Ce procédé de fabrication ischémie globale du cerveau est l'un des protocoles multiples. Nous utilisons ce protocole avant tout pour son taux relativement bas de mortalité, une récupération rapide et des résultats reproductibles. Le modèle d'arrêt / réanimation cardiaque est sans …

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH