2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

Summary

全身性低血圧と相まって、二国間の頸動脈閉塞は再現重症度と海馬への損傷、その結果、ラットの全脳虚血を生成します。動物の被験者は脳損傷の予測可能なパターンで損なわれて、彼らは便宜上回復し、死亡率は比較的低いです。

Abstract

蘇生が続く心停止は、しばしば虚血と脳のその後の再灌流によって生じる劇的脳損傷につながる。グローバルな脳虚血、虚血¹に非常に敏感であることが示された特定の脳領域への損傷を生成します。海馬ニューロンは、具体的に他の細胞集団、とに比べて虚血性傷害に高い感度を持って、海馬のCA1領域は虚血/再灌流²に対して特に脆弱です。

治療的介入の設計、または脳損傷に関与するメカニズムの研究は、臨床症状と類似して再現可能な方法で被害を生成モデルを必要とします。低血圧との二国間頚動脈血管閉塞（2VOH）が心停止と蘇生中に発生する可能性がある脳のイベントをエミュレートする、可逆前脳虚血を生成するモデルである。私たちは、Smith らから変更モデルを記述。 ^（1984）2、第1のサンダーソンら ^{（2008）3、}選択的に脆弱な脳領域^3-6に再現可能な傷害を作り出すに現在の形で提示。このモデルの信頼性を印加低血圧、血期間、近い温度制御、特定の麻酔レジメンおよび勤勉術後ケア時に全身血圧を正確に制御することによって決定される。 8分の虚血性傷害が少なく脆弱な脳領域が免れている間、再灌流の6〜24時間の経過とともに進行CA1海馬ニューロンの細胞死を生成します。この漸進的な細胞死を容易にCA1ニューロンのほぼ完全な消失が、この時点で明らかなように、再灌流の7〜14日後に定量化される。

この脳損傷モデルに加えて、我々は、単純な、まだ完全な、方法論を用いてCA1ダメージ定量方法を提案する。重要なことに、定量化は、単純なカメラマウント顕微鏡を用いて達成することができるダ自由ImageJの（NIH）ソフトウェアプラグイン、コスト法外立体学のソフトウェアプログラムおよび損傷評価のための電動顕微鏡のステージを不要。

Introduction

心停止や脳卒中の結果として脳の損傷は、死と長期障害の主要な原因である。心停止の被害者のための心肺蘇生法は、これらの患者の60％は、その後、病院で死亡、少なくとも広範な脳損傷の結果として、米国の^7,8では年間約70,000人の患者の自発的な循環を復元することに成功している間だけ3から10パーセント蘇生患者の^9,10は彼らのかつての暮らしを再開することができます。明らかに、世界的脳虚血に続くと神経外傷を最小限に抑えるために治療的介入を設計する脳の損傷につながるメカニズムを理解することが極めて重要である。

脳虚血は、複数の方法を用いてモデル化することができる。最も一般的には、脳虚血は、このように焦点虚血性脳卒中^11,12を製造する、脳、中大脳動脈の主要な血管を閉塞することにより齧歯類で製造される。臨床的に重要ながら、局所脳虚血は、心停止/蘇生によって生成された脳の損傷を研究するための正確な方法ではありません。この臨床パラダイムをモデル化するために脳全体が虚血が血流の再導入が続く行わなければならない。密接にこの臨床症状を模倣するために、研究者が実験的にCPRや除細動^13,14と蘇生に続いて心停止を誘導する。このモデルは臨床的に関連している、しかし、予測不可能な蘇生時間が変動性を高めることができると解釈し、データ解析を困難にすることができる。また、このモデルはさらに仮説を検証するために必要な動物の数を増加させる、高い死亡率に関連付けられる。より、再現性、一貫性と存続侮辱のグローバル虚血および/または再灌流に対する脳の応答が好ましいかもしれない調査。

いくつかの全身の血流を維持しながら、全虚血は、脳内に誘導することができる。 investigatioを可能にしながら、死亡率を減少させるnは²で脳組織損傷のメカニズムである。全脳虚血を製造するためには、中断したり大幅に脳内頚動脈と椎骨動脈を供給するすべての4つの容器内での流れを制限する必要がある。これらの血管は、吻合ループを形成ウィリスのサークルと呼ばれる血管構造を通して血流と脳を供給。この血管のアーキテクチャでは、脳は、近位血管閉塞が発生した場合の血流を保持することができます。したがって、脳の完全な虚血を誘発するために、すべての拠出血管を通る血流が発生しなければなりません。頸動脈の動脈閉塞が所望の期間の動脈瘤クリップの低侵襲腹ネックカットダウン及びアプリケーションを使用して達成することができる。彼らは脊柱の横孔をでincasedれると椎骨動脈を経由して血流の中断は、困難になる可能性があります。調べでは、椎骨動脈の頸動脈の前に24〜48時間をelectrocauterizingによってこれを対処している咬合と脳虚血（4VOモデル^）15。このアプローチとは対照的に、Smith ら血流が^2を紛失したり大幅に低減される点に椎骨動脈を通って血流を低減するために40 mmHgでまで全身動脈圧（MAP）を意味低減することにより全脳虚血を誘導する方法を開発した。頚動脈閉塞と相まって場合、このメソッドは、密接に心停止の生存者のことを模倣し、脳の損傷のパターンで、その結果、脳全体に血を生成します。この方法のさらなる改良では、我々はここで紹介するモデルは30 mmHgのでタイトMAPレギュレーション±1mHg虚全体の8分の間に必要になります。我々は、Smith らのアイディア独自の技術の低い死亡率を維持しながら、この変化は、このモデルによって誘発される脳損傷の再現性を向上させる発見した。

細胞死によって引き起こされる組織損傷の全体的な程度の正確な表現型ここで紹介するモデルは、虚血性持続¹⁶に直接依存しています。 CA1ニューロンは再灌流段階^15,17間に治療的介入のための一時的なウィンドウがあることを示唆し、細胞死を遅らせ、虚血の8分を示す以下の。再灌流の開始時に、ニューロンは素早く機能を取り戻し、即時の細胞死が¹⁸検出されない。しかし、この侮辱は細胞死カスケードの誘導（アポトーシス）再灌流^3,19の4-6時間の間にシトクロム c、含むミトコンドリアからapoptogenicタンパク質のリリースでその絶頂に達するを引き起こす。再灌流の6と24時間の間に、CA1海馬のニューロンは細胞崩壊にコミットしており、アポトーシス細胞死のプログラムが^19に実行されます。これは、虚血性損傷を担当細胞死の表現型は非常に議論の余地があることに留意すべきである。他の他の人がapoptを報告しながら、初期の研究では、壊死が主細胞死の表現型^20,21で示唆されている主要メカニズム^22,23としてOSIS。合計では、現在の証拠は、細胞が、古典的なアポトーシスから壊死に至るまで細胞死表現型のスペクトルの死ぬことを示唆している。細胞死の特定のモードでは、それぞれの表現型の寄与の度合いが他の要素^24,25の中で、侮辱の重大度に応じて、多くの要因に依存しています。再灌流の24時間で、死細胞が濃縮した核、集約された携帯電話の内容の明確な証拠と凝縮された細胞質、機能ミトコンドリアの形態の損失を持っています。死んだ細胞は、さらに、分解などのマクロファージおよび/またはミクログリアなどの免疫細胞に包まれ、CA1海馬領域か​​ら消去されます。再灌流の4-7日で、死んだ細胞を除去し、すべてのことに変わりは^17,26炎症細胞および活性化グリア細胞であるされています。したがって、再灌流の7日はCA1海馬神経細胞死が単純な、非特定のセルの汚れを使用して定量化することができる最適な時間を表しクレシルバイオレットまたはヘマトキシリン​​·エオシンをcludingと形態学的包含基準に基づいてカウント。この後半の再灌流間隔で残りのセルは、このような脳損傷の指標を提供し、生存細胞としてカウントすることができます。

このモデルは、治療介入をテストするために利用される場合には、実験計画はSTAIR基準（ストローク療法論文界ラウンドテーブル^）27に従うことが示唆された。設計や研究を行う場合は、次のガイドラインに従うべきである、しかし、ここでは説明しません。

Protocol

1。準備全ての動物実験は、機関のガイドラインに準拠し、開始する前に、それぞれの動物ケア委員会による承認を受けなければならない。すべての手順は、ウェイン州立大学制度動物のケアと使用委員会によって承認されている、ここで提示され、実験動物のケアと使用するためのガイドに出すように、動物の倫理的な処置のガイドラインに従ってくださいとのための米…

Representative Results

グローバルな脳虚血/再灌流の2VOHモデルは、海馬のCA1領域の神経細胞死を引き起こす。 図2は 14日間再灌流後に処理、グローバルな脳虚血の8分で生成けがを表しています。 図2Aおよび2Bは、偽から海馬を比較し、クレシルバイオレットで染色した虚血後の脳は、 図2AはそのままCA1を含め、正常な形態を示す偽手術ラットから海馬を示していま?…

Discussion

ここで説明されたモデルは、ヒトで見られるものと同様の傷害を提供し、心停止および蘇生の結果として発生する可能性がある脳の虚血性傷害を生成する。全脳虚血を製造するためのこの方法は、複数のプロトコルの一つである。我々は、その比較的低い死亡率、急速な回復、および再現性のある結果を得るために何よりも、このプロトコルを利用する。心停止/蘇生モデルは、しかし技術的…

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH