2-kärlocklusion / Hypotension: En Rat modell för Global hjärnischemi

Summary

Bilateralt halspulsådern ocklusion kombination med systemisk hypotension producerar globala hjärnischemi i råtta, vilket resulterar i skador på hippocampus med reproducerbar svårighetsgrad. Djurförsök är nedsatt med förutsägbara mönster av hjärnskada, återkräva de ändamålsenligt, och dödligheten är jämförelsevis låga.

Abstract

Hjärtstillestånd följt av återupplivning resulterar ofta i dramatisk hjärnskador orsakade av ischemi och efterföljande reperfusion av hjärnan. Global hjärnischemi producerar skador på specifika delar av hjärnan visat sig vara mycket känsliga för ischemi ^1. Hippocampus nervceller har högre känslighet för ischemiska skador jämfört med andra cellpopulationer, och specifikt är CA1 regionen av hippocampus särskilt utsatta för ischemi / reperfusion ^2.

Utformningen av terapeutiska ingripanden, eller för att studera mekanismer som är involverade i cerebral skada, kräver en modell som ger skador som liknar den kliniska tillstånd och på ett reproducerbart sätt. Bilateral carotid kärlocklusion med hypotension (2VOH) är en modell som ger reversibel framhjärna ischemi, efterlikna de cerebrala händelser som kan inträffa under hjärtstillestånd och återupplivning. Vi beskriver en modell modifierad från Smith et al. (1984) ², Som presenterades för första gången i sin nuvarande form i Sanderson et al. (2008) ^3, vilket ger reproducerbar skada att selektivt sårbara hjärnregioner ^3-6. Tillförlitligheten i denna modell styrs av exakt styrning av det systemiska blodtrycket under tillämpad hypotension, varaktighet ischemi, nära temperaturkontroll, en specifik anestesi regim, och flitig postoperativ vård. En 8-minuters ischemisk insult producerar celldöd av CA1 hippocampus nervceller som fortskrider under loppet av 6 till 24 timmar av reperfusion, medan mindre känsliga områden i hjärnan skonas. Denna progressiva celldöd är lätt kvantifieras efter 7-14 dagar av reperfusion, som en nära total förlust av CA1 neuroner är uppenbart vid denna tid.

Utöver detta hjärnskada modell presenterar vi en metod för CA1 skada kvantifiering med hjälp av en enkel men noggrann, metodik. Viktigt kan kvantifiering åstadkommas med hjälp av en enkel kamera monterad på mikroskop, enda gratis ImageJ (NIH) software plugin, vilket undanröjer behovet av kostsamt program stereology programvara och ett motoriserat mikroskopisk scen för skadebedömning.

Introduction

Hjärnskador till följd av hjärtstillestånd och stroke är en ledande dödsorsak och långvarig funktionsnedsättning. Även hjärt-lungräddning till offer för hjärtstillestånd lyckas återställa spontan cirkulation i ca 70.000 patienter per år i USA ^7,8 minst 60% av dessa patienter senare dör på sjukhuset till följd av omfattande hjärnskador och endast 3-10% av resuscitated patienter kan återuppta sin tidigare livsstil ^9,10. Tydligt, att förstå de mekanismer som leder till hjärnskador efter global hjärnischemi och utforma terapeutiska interventioner för att minimera neurologiska trauma är av avgörande betydelse.

Hjämischemi kan modelleras använda flera metoder. Vanligast är hjämischemi produceras i gnagare genom att blockera ett större blodkärl i hjärnan, den mellersta cerebral artär, vilket ger en fokal ischemisk stroke ^11,12. Medan kliniskt betydelsefull,fokal hjärnischemi är inte en exakt metod för att studera hjärnskador produceras av hjärtstillestånd / lungräddning. För att modellera detta kliniska paradigm hela hjärnan måste göras ischemisk följt av återinförande av blodflödet. För att efterlikna detta kliniska presentation, utredare framkallar experimentellt hjärtstillestånd följt av återupplivning med HLR och defibrillering ^13,14. Denna modell är kliniskt relevant, kan dock oförutsägbara återupplivning tider ökar variabilitet och kan göra dataanalys svårtolkad. Dessutom är denna modell förknippad med en hög dödlighet, vilket ytterligare ökar djur antal som krävs för att testa en hypotes. Undersökning den cerebrala svar på den globala ischemi och / eller reperfusion i en mer reproducerbar, konsekvent och överleva förolämpning kan föredras.

Global ischemi kan induceras i hjärnan samtidigt bevara några blodflödet systemiskt. Detta minskar dödligheten, samtidigt som investigation av mekanismerna för vävnadsskador i hjärnan ^2. För att producera globala hjärnischemi, är det nödvändigt att avbryta eller kraftigt begränsa flödet i alla fyra fartyg som försörjer hjärnan, de interna halspulsåder och vertebrala artärerna. Dessa blodkärl förser hjärnan med blod flöde genom en vaskulär struktur som kallas Circle of Willis, som bildar en anastomotisk loop. Denna vaskulära arkitektur tillåter hjärnan att behålla perfusion i händelse av proximala vaskulär ocklusion. Därför måste för att inducera fullständig ischemi i hjärnan, blodflödet genom alla bidragande fartyg inträffa. Carotid artärocklusion kan åstadkommas med användning av en minimalt invasiv ventral hals nerskuret och tillämpning av aneurism klipp för en önskad period. Avbrott av blodflödet genom de vertebrala artärerna kan vara svårt, eftersom de är incased i tvärgående foramina av ryggraden. Utredarna har tagit upp detta genom att electrocauterizing de vertebrala artärerna 24-48 h före carotidocklusion och hjämischemi (4VO modell) ^15. I motsats till denna metod som utvecklades Smith et al. Ett förfarande för inducering av global hjärnischemi genom att minska det genomsnittliga arteriella blodtrycket (MAP) systemiskt till 40 mmHg för att reducera perfusion genom de vertebrala artärerna till en punkt där blodflödet går förlorad eller kraftigt minskas ² . När den kombineras med halspulsådern ocklusion, producerar denna metod ischemi hela framhjärnan, vilket resulterar i ett mönster av hjärnskada som nära efterliknar det av hjärtstopp överlevande. I en ytterligare förfining av denna metod, kräver den modell vi presenterar här tight MAP reglering vid 30 mmHg ± 1mHg under hela 8 minuter av ischemi. Vi hittade denna förändring förbättrar reproducerbarhet av hjärnskada inducerad av denna modell samtidigt som den låga dödligheten för den ursprungliga tekniken designad av Smith et al.

Den exakta fenotypen av celldöd och allmänt omfattningen av vävnadsskada orsakad avden modell som presenteras här är direkt beroende av ischemisk varaktighet ^16. Efter 8 minuter av ischemi, uppvisar CA1 nervceller fördröjd celldöd, vilket tyder på att det finns en tidsmässig fönster för terapeutisk intervention under reperfusionsfasen ^15,17. Vid början av reperfusion, neuroner återfå snabbt funktion och ingen omedelbar celldöd är detekterbar ^18. Men denna förolämpning orsakar induktion av kaskader celldöd (apoptos) som kulminerar i frisättning av apoptogenic proteiner från mitokondrier, däribland cytokrom c, mellan 4-6 tim reperfusion ^3,19. Mellan 6 och 24 timmar av reperfusion, har nervceller i CA1 hippocampus åtagit sig att cellens död, och den apoptotiska celldöd exekveras ^19. Det bör noteras att celldöd fenotyp ansvarar för ischemisk skada är mycket kontroversiell. Tidiga studier har antytt nekros är den primära celldöd fenotyp ^20,21, medan andra andra rapporterar apoptOsis som den huvudsakliga mekanismen ^22,23. Totalt aktuellt bevis tyder på att cellerna dör av ett spektrum av fenotyper celldöd sträcker sig från klassiskt apoptos till nekros. Det specifika läget av celldöd är beroende av många faktorer, med graden av bidraget från varje fenotyp beroende på svårighetsgraden av förolämpning, bland andra faktorer ^24,25. Av 24 h av reperfusion, döende celler besitter pyknotiska kärnor, kondenserad cytosolen med tydliga tecken på aggregerade cellulära innehåll, och förlust av funktionell mitokondriell morfologi. Döda celler delas upp ytterligare, uppslukas av immunceller såsom makrofager och / eller mikroglia, och rensat från CA1 hippocampus regionen. Genom 4-7 dagar reperfusion, är döda celler avlägsnas, och allt som återstår är inflammatoriska celler och aktiverade gliaceller ^17,26. Därför representerar 7 dagar av reperfusion en optimal tid där CA1 hippocampus nervcellsdöd kan kvantifieras med hjälp av enkla, icke-specifika celler fläckar isive kresylviolett eller hemotoxylin-eosin och räknade utifrån morfologiska inklusionskriterier. Celler kvar vid denna sena reperfusion intervall kan räknas som överlevande celler, vilket ger ett index av hjärnskador.

Om denna modell är att användas för att testa terapeutiska åtgärder, föreslås det att den experimentella designen följer TRAPPOR kriterier (Stroke Terapi Academic Industri Roundtable) ^27. Dessa riktlinjer bör följas vid utformning och genomförande av en studie, som dock inte diskuteras här.

Protocol

Ett. Framställning Alla djurförsök måste följa institutionens riktlinjer och få ett godkännande av en respektive djurvård utskott före initiering. Alla förfaranden som presenteras här har godkänts av Wayne State University Institutional Animal Care och användning kommittén och följa riktlinjerna för etisk behandling av djur som tas fram i Guide för skötsel och användning av försöksdjur samt till den amerikanska regeringen Principer för Utnyttjande och skötsel av ryggrads…

Representative Results

Den 2VOH modell av global hjärnischemi / reperfusion orsakar nervcellsdöd i CA1 regionen av hippocampus. Figur 2 representerar den skada som produceras av 8 min av global hjärnischemi, bearbetas 14 dagar efter reperfusion. Figurerna 2A och 2B jämför hippocampi från bluff och post-ischemiska hjärnor, färgade med kresylviolett. Figur 2A visar en hippocampus från en skenopererade råtta som uppvisar normal morfologi, inklusive ett intakt CA1. <str…

Discussion

Den modell som beskrivs här ger en ischemisk skada på hjärnan som kan uppstå som en följd av hjärtstillestånd och återupplivning, vilket ger en skada liknande den som finns hos människor. Denna metod för att producera globala hjärnischemi är en av flera protokoll. Vi använder det här protokollet främst för dess jämförelsevis låg dödlighet, snabb återhämtning, och reproducerbara resultat. Den hjärtstillestånd / återupplivning modell är utan tvekan den mest kliniskt relevant modell, men tekniskt …

Materials

			Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
			Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
			Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
			Software
ImageJ	NIH