Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Summary

Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais de entrega de genes.

Abstract

Non-viral de entrega de genes utilizando nanopartículas poliméricas emergiu como uma abordagem atraente para a terapia de gene para tratar ^uma doença genética e como uma tecnologia para a medicina regenerativa ^2. Ao contrário dos vírus, que têm problemas de segurança significativos, as nanopartículas de polímeros pode ser concebido para ser não-tóxico, não-imunogénicas, não mutagénica, mais fáceis de sintetizar quimicamente versátil, capaz de transportar cargas maiores de ácidos nucleicos e biodegradável e / ou ambientalmente sensíveis. Os polímeros catiónicos auto-montar com o DNA carregado negativamente pela interacção electrostática, para formar os complexos da ordem de 100 nm, que são normalmente chamados de nanopartículas poliméricas. Exemplos de biomateriais usados ​​para formar nanopartículas nanoescala de entrega de genes policatiónicos incluem polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoaminas) s e polietilenoimina (PEI), que é um não-degradável off-the-shelf polímero catiónico vulgarmente utilizados para a entrega de ácidos nucleicos ^1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) são uma nova classe de polímeros catiónicos que sejam ⁴ hidroliticamente degradável ^5,6 e têm-se mostrado eficazes na entrega de genes em tipos de difícil transfectam de células, tais como células endoteliais humanas da retina (HRECs) ^7, células epiteliais mamárias de rato ^8, células cerebrais humanas cancerosas ⁹ e macrovasculares (veia umbilical humana, HUVECs) células endoteliais ^10.

Um novo protocolo para a caracterização de nanopartículas poliméricas utilizando análise de nanopartículas de rastreamento (NTA) é descrito. Nesta abordagem, tanto a distribuição do tamanho de partícula e da distribuição do número de plasmídeos por partícula são obtidos ^11. Além disso, um alto rendimento de ensaio de transfecção placa de 96 poços para rastreio rápido da eficácia de transfecção de nanopartículas poliméricas é apresentado. Neste protocolo, o poli (beta-amino éster) s (PBAEs) são utilizados como polímeros de modelo e da retina humana (células endoteliais HRECs) são utilizados como model células humanas. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para avaliar qualquer nanopartícula de polímero e de qualquer tipo de células de interesse num formato de placa de multi-poços.

Introduction

A determinação do número de plasmídeos complexados por nanopartículas é importante desenhar eficazes de nanopartículas à base de estratégias de distribuição de genes, em particular para co-entrega de plasmídeos múltiplos para a mesma célula-alvo, tal como muitas vezes é necessário reprogramar os estudos de células estaminais ^12. Algumas abordagens para calcular o número de plasmídeos associados com uma nanopartícula única têm sido descritos, e cada método tem desvantagens das técnicas usadas para a estimativa de ^13-16. Quantum dot rotulagem (QD), combinada com MET foi utilizada para estimar os plasmídeos por partícula de quitosano baseada em nanopartículas. Estimativa com esta técnica QD é complicado devido à necessidade de rotular o DNA, o que pode alterar as suas propriedades de auto-montagem, a possibilidade de que o DNA não marcado encapsulado não é directamente detectada; plasmídeos potencialmente sobrepostos e QDs nas imagens de TEM 2D de partículas, e outras hipóteses simplificadoras ^13. Uma abordagem alternativa, que é umAPLICÁVEL microdomínios quando ordenados existir nas partículas tem sido usado para estudar lipopoliamina-DNA por meio de complexos de crio-microscopia electrónica de transmissão (Cryo-TEM), dispersão de raios X e dispersão dinâmica de luz (DLS) ^14,15. Infelizmente, os materiais, tais como as nanopartículas de polímeros investigados aqui, não são aplicáveis ​​a este método. . Em outro estudo, Collins et al utilizaram um fluxo de partículas técnica de análise de imagem para o estudo (Lys) ₁₆ contendo peptídeos / DNA complexos, no entanto, o seu método só pode avaliar maiores, micron de tamanho de partículas ^16. Assim, foi recentemente desenvolvido um ensaio de novo e flexível para quantificar o número de plasmídeos por nanopartículas de ^11.

Protocol

1. Sementeira celular Não permitir que as células a crescer para overconfluency. Usar células de passagem iniciais, quando a transfecção de células primárias. Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células Tripsinizar, contar as células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão de células com meio para atingir a densidade celular desejada (células / volume). Células de sementes para cultura de tecidos clara-tratado de fundo plano de 96 poços, utilizando um reservat?…

Representative Results

A Figura 1 mostra uma imagem de microscopia de fluorescência de um exemplo de uma transfecção bem sucedida de HRECs com o plasmídeo EGFP. A imagem de campo claro é útil para assegurar que as células mantêm a sua morfologia normal. Além disso, os ensaios de viabilidade celular, tais como ensaios de MTS ou semelhantes, pode ser utilizado para avaliar a toxicidade das nanopartículas 7. A citometria de fluxo, tal como descrito, pode ser utilizado para quantificar a eficiência da transf…

Discussion

Os protocolos acima descrevem métodos para avaliar a eficácia de transfecção de formulações de nanopartículas, bem como uma maneira de caracterizar o tamanho de partícula e carga de DNA das nanopartículas. O número de plasmídeos por partícula é um parâmetro importante que pode ajudar a prever a eficácia da partícula e pode também ser usado para a determinação de dose. Análise de rastreamento de nanopartículas pode ser realizado em uma variedade de diferentes soluções aquosas, tais como os que dife…

Materials

			Reagent
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Trypsin	Invitrogen	25300
Sodium acetate buffer	Sigma-Aldrich	S7899	Dilute to 25mM in deionized water
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP DNA	Elim Biopharmaceuticals	NA
DsRed DNA	Addgene	21718
PEI, branched	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 AQueous One	Promega	G3580
			Materials
Clear flat bottom 96-well plate, sterile	Sarstedt	82.1581.001
Clear round bottom 96-well plate, sterile	Sarstedt	82.1582.001
12-channel Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 and 50-300 μl
Fluorescence Microscope	Zeiss	NA	Model number: AX10
C6 Accuri flow cytometer	BD Biosciences	NA
HyperCyt attachment	Intellicyt	NA
NS500	Nanosight	NA