Vi rapporterer en metode for å isolere naive multipotent hud-derived forløper (SKP) celler fra primære humane fibroblastkulturer. Vi viser at disse sKPs avledet fra fibroblastkulturer dele lignende stamcelleegenskaper til de som stammer direkte fra menneskelig hud biopsier. Disse cellene uttrykke neural crest markør, nestin, i tillegg til de multipotent markører som OCT4 og Nanog.
I løpet av det siste tiåret har flere voksne stamceller populasjoner blitt identifisert i menneskelig hud 1-4. Isolering av multipotent voksne dermal forløpere ble først rapportert av Miller F. D 5 laboratorium, 6. Disse tidlige studiene beskrev en multipotent forløper celle befolkningen fra voksen pattedyr dermis fem. Disse cellene – kalt sKPs, for hud-deriverte forløpere – ble isolert og utvidet fra gnagere og menneskelig hud og differensiert i både nevrale og mesodermal avkom, inkludert celletyper aldri funnet i huden, slik som nevroner fem. Immuncytokjemisk studier på kultiverte sKPs avdekket at cellene uttrykte vimentin og nestin, en mellomliggende filament protein uttrykt i nevrale og skjelettmuskulatur forløpere, i tillegg til fibronectin og multipotent stamcelle markører seks. Inntil nå har de voksne stamceller befolkningen sKPs vært isolert fra ferske innsamlede pattedyr hud biopsier.
ve_content "> Nylig har vi etablert og rapporterte at en befolkning på hud avledet forløper celler kunne være tilstede i grunnskolen fibroblastkulturer etablert fra hud biopsier 7. Antakelsen om at noen somatiske stamceller kan ligge i grunnskolen fibroblastkulturer på tidlige befolkningen doublings var basert på følgende observasjoner: (1) sKPs og primære fibroblastkulturer er utledet fra dermis, og derfor et lite antall SKP celler kan være tilstede i dermale primære fibroblastkulturer og (2) primære fibroblastkulturer dyrket fra frosne alikvoter som har vært utsettes for ugunstig temperatur under lagring eller overføring inneholdt et lite antall celler som forble levedyktige 7.. disse sjeldne cellene var i stand til å utvide seg og kan passeres flere ganger. Denne observasjon antydet at et lite antall celler med høy spredning potens og resistens mot stress var til stede i menneskelige fibroblastkulturer 7.Vi benyttet av disse funnene for å etablere en protokoll for hurtig isolering av voksne stamceller fra primære fibroblastkulturer som er lett tilgjengelig fra vev bredden over hele verden (se figur 1). Denne metoden har viktig betydning som det lar isolering av forløper celler når huden prøver er ikke tilgjengelig mens fibroblastkulturer kan være tilgjengelig fra vev banker, og dermed åpner nye muligheter til å dissekere de molekylære mekanismene bak sjeldne genetiske sykdommer samt modellering sykdommer i en parabolen.
Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet heri, kan naive dermale stamceller bli isolert fra primære fibroblastkulturer dermale. Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi nylig rapporterte isolering og karakterisering av voksne stamceller fra fibroblastkulturer stammer fra pasienter med en sjelden genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom 7. Som viser her de forløper celler uttrykker stamcelle markører er i stand til selvfornyelse og kan rettes til å differensiere i ulike cellulære linjene inkluder…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation (5090371), den Christine Kühne Center for Allergy forskning og utdanning (CK-CARE), og Bayerischen Staatsministerium (til KD).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
Methanol | Roth | 8388.2 | |
Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
Table 2. Specific reagents and equipment. |