Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model
Summary
Bestemmelse donorcelle engraftment er en udfordring i mus knoglemarvstransplanterede modeller, der mangler veldefinerede fænotypiske markører. Vi beskrev en metode til at kvantificere mandlig donorcelle indpodning hos kvindelige transplantation recipientmus. Denne metode kan anvendes i alle musestammer til studiet af HSC funktioner.
Abstract
Murine knoglemarvstransplantation modeller giver et vigtigt redskab til måling af hæmatopoietiske stamceller (HSC) funktioner og bestemme gener / molekyler, der regulerer HSCs. I disse transplanterede modelsystemer, er funktionen af HSCs bestemt ved evnen af disse celler til indpode og rekonstituere letalt bestrålede recipientmus. Almindeligvis donorcellen bidrag / engraftment målt ved antistoffer mod donor-specifikke celleoverfladeproteiner ved anvendelse af flowcytometri. Men denne metode afhænger i høj grad af specificitet og evnen af celleoverflademarkør at differentiere donor-afledte celler fra recipient-stammer celler, som måske ikke er tilgængelige for alle musestammer. Blandt de forskellige baggrunde af genetisk modificerede musestammer på markedet, denne celleoverfladen / flowcytometri-baseret metode har væsentlige begrænsninger især i musestammer, som mangler veldefinerede overflademarkører at adskille donorceller fra congene recipient ceLLS. Her vi rapporteret en PCR-baseret teknik til at bestemme donorcelle engraftment / bidrag transplantation recipientmus. Vi transplanteret mandlige donorknoglemarv HSCs til letalt bestrålede kongene hunmus. Perifere blodprøver blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transplantation. Knoglemarvsprøver blev opnået ved afslutningen af forsøgene. Genomisk DNA blev isoleret og Y-kromosomet specifikt gen, Zfy1, blev amplificeret ved brug af kvantitativ real time PCR. Den indpodning af mandlige donor-afledte celler i de kvindelige recipientmus blev beregnet mod standardkurve med kendte procentdel af mandlige vs kvindelige DNA'er. Bcl2 blev anvendt som reference-gen at normalisere den totale DNA beløb. Vore data tydede på, at denne fremgangsmåde pålideligt bestemmer donorcelle engraftment og giver en nyttig, men enkel fremgangsmåde til måling af hæmatopoietisk celle rekonstituering i murine knoglemarvstransplantation modeller. Vores metode kan rutinemæssigt udføres i de fleste laboratorier, da ingendyrt udstyr, såsom flowcytometri er påkrævet.
Introduction
Murin knoglemarv (BM) transplantation model blev først udviklet i 1960'erne 1. Denne model er blevet omfattende anvendt til undersøgelse af donor hæmatopoietisk stamcelle (HSC) biologi i en vært recipient mus. Murin knoglemarvstransplantation model har givet os værdifuld viden om HSC funktioner og deres regulering, og er uundværlig i HSC forskning. Allogen knoglemarvstransplantation model som C57BL/6J H2b-Balb / C H2d eller kongene transplantation model som C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 anvendes i mange laboratorier for at studere genfunktion på HSC aktivitet 2, virkningen af lægemiddelbehandling på HSC funktion 3 eller transplantation sygdomme, såsom graft-versus-vært sygdom (GVHD) 4.
Celleoverflademarkører, såsom MHC haplotype eller CD45.1 er almindeligt anvendt til at skelne mellem donor-afledte celler fra recipient-stammer celler. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup>, Balb / C H2d og B6.SJL CD45.1 er de mest almindeligt anvendte musestammer i knoglemarvstransplantation, fordi donorcellen bidrag kan let vurderes ved flow-cytometri måling CD45.1 mod CD45.2 eller H2b vs H2d. Men mange andre stammer, såsom FVB / NJ 5 og C3H også ofte til at generere genetisk manipuleret transgene eller knockout-mus. Disse mus kan tilbagekrydset til en indavlet linie og holdes i en blandet genetisk / MHC baggrund. I disse tilfælde kunne bestemme donorcelle engraftment og HSC funktionen være vanskeligt som donor specifik-celleoverflademarkører ikke kan være til rådighed.
Ved hjælp af Y-kromosom-specifik DNA-probe til påvisning donor mandlige celler ved Southern blot i sex-mismatchede knoglemarvstransplantation blev først udviklet af Dr. Miwa gruppe 6. Derefter blev en real-time PCR for sex-bestemmende region Y sig at være en nøjagtig og yderst specifik metode til kvantificering af male føtale celler i moderblod system 7. Dette koncept blev tilpasset af Dr. Schwarzenberger gruppe for udvikling af en real-time PCR teknik i et murint knoglemarvstransplantation til bestemmelse donorcelle engraftment 8. Vi yderligere modificeret denne metode til måling af donorcellen indpodning i FVB / NJ mus knoglemarvstransplantation model. Denne metode er i øjeblikket udstrakt grad i vores gruppe for at studere den rolle Pim1 kinase i HSC biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med vores nuværende undersøgelse er at give publikum en PCR-baseret teknik til at kvantificere donorcelle indpodning i et konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation model. Adskillige undersøgelser er blevet rapporteret under anvendelse af RT-PCR til påvisning af donorceller i transplantation modeller 9-10. Dr. Schwarzenberger gruppe først udviklede en murin knoglemarvstransplantation model ved hjælp af real-time PCR til amplifikation y-kromosom-specifik 8. Denne metode blev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Charles Greenberg for brugen af hans Real time PCR maskine. Dette arbejde understøttes af Musc Hollings Cancer Center Startup Fund, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103.780-01A1, og NIH 3P30CA138313-01S3. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health eller andre finansieringskilder midler.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
