मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करने के लिए एक प्रतियोगी murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में दाता कोशिका engraftment निर्धारित
Summary
दाता कोशिका engraftment निर्धारण माउस अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल है कि अच्छी तरह से परिभाषित phenotypical मार्करों की कमी में एक चुनौती प्रस्तुत करता है. हम एक पद्धति का वर्णन करने के लिए महिला प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों में पुरुष दाता सेल engraftment यों. इस विधि HSC कार्यों के अध्ययन के लिए सभी माउस उपभेदों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल hematopoietic स्टेम सेल (HSC) कार्यों और निर्धारित जीन / अणुओं है कि HSCs को विनियमित मापने में एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं. इन प्रत्यारोपण मॉडल प्रणाली में, HSCs की समारोह में इन कोशिकाओं की पैवंद करना और reconstitute lethally विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों की क्षमता से निर्धारित होता है. आमतौर पर, दाता सेल / योगदान engraftment दाता विशिष्ट सेल सतह प्रवाह cytometry का उपयोग प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी द्वारा मापा जाता है. हालांकि, इस पद्धति भारी विशिष्टता और सेल सतह मार्कर के प्राप्तकर्ता उत्पन्न कोशिकाओं है, जो सभी माउस उपभेदों के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता से दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता पर निर्भर करता है. बाजार में आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों के विभिन्न पृष्ठभूमि को ध्यान में रखते हुए, इस कोशिका की सतह / प्रवाह cytometry आधारित पद्धति माउस उपभेदों कि congenic प्राप्तकर्ता ce से अलग दाता कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से परिभाषित सतह मार्कर की कमी में विशेष रूप से महत्वपूर्ण सीमाएँ हैंLLS. यहाँ, हम एक पीसीआर आधारित तकनीक प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों में दाता सेल engraftment / योगदान निर्धारित की सूचना दी. हम lethally विकिरणित congenic मादा चूहों पुरुष दाता अस्थि मज्जा HSCs प्रतिरोपित. परिधीय रक्त के नमूनों के अलग अलग समय बिंदुओं के बाद प्रत्यारोपण में एकत्र किए गए. अस्थि मज्जा के नमूनों प्रयोगों के अंत में प्राप्त किया गया. जीनोमिक डीएनए अलग किया गया था और वाई गुणसूत्र विशिष्ट जीन, Zfy1, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग प्रवर्धित किया गया था. महिला प्राप्तकर्ता चूहों में पुरुष दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के engraftment पुरुष बनाम महिला DNAs के ज्ञात प्रतिशत के साथ मानक वक्र के खिलाफ गणना की गई. Bcl2 कुल डीएनए राशि सामान्य के लिए एक संदर्भ के लिए जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. हमारे डेटा का सुझाव दिया है कि इस दृष्टिकोण मज़बूती दाता कोशिका engraftment निर्धारित करता है और murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में hematopoietic सेल पुनर्गठन मापने में उपयोगी है, अभी तक सरल तरीका प्रदान करता है. हमारे विधि नियमित ज्यादातर प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है क्योंकि कोईप्रवाह cytometry के रूप में इस तरह के महंगे उपकरण की आवश्यकता है.
Introduction
Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण (बीएम) मॉडल 1 1 1960 के दशक में विकसित किया गया था. इस मॉडल को बड़े पैमाने पर किया गया है दाता hematopoietic स्टेम सेल (HSC) एक मेजबान प्राप्तकर्ता माउस में जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल हमें HSC कार्यों और उनके विनियमन पर बहुमूल्य ज्ञान के साथ प्रदान की गई है और HSC अनुसंधान में अपरिहार्य है. Allogeneic C57Bl/6J / H2b Balb सी H2d है या जैसे – B6.SJL CD45.1 CD45.2 C56Bl/6J congenic प्रत्यारोपण मॉडल की तरह अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल कई प्रयोगशालाओं में किया जाता है HSC 2 गतिविधि पर जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए, प्रभाव की भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GvHD) 4 जैसे HSC 3 समारोह या प्रत्यारोपण से संबंधित रोगों पर दवा उपचार.
MHC haplotype या CD45.1 के रूप में सेल सतह मार्करों आमतौर पर प्राप्तकर्ता उत्पन्न कोशिकाओं से भेद दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है. C57Bl/6J H2b, CD45.2 </sup>, / Balb सी H2d और B6.SJL CD45.1 अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण में सबसे अधिक इस्तेमाल किया माउस उपभेदों हैं क्योंकि दाता कोशिका योगदान को आसानी से प्रवाह cytometry CD45.1 बनाम CD45.2 या बनाम H2b मापने द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है H2d. हालांकि, / FVB 5 न्यू जर्सी और C3H के रूप में कई अन्य उपभेदों भी अक्सर अनुवांशिक इंजीनियर ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया. इन चूहों को एक जन्मजात लाइन backcrossed किया जा सकता है और एक मिश्रित आनुवंशिक पृष्ठभूमि / MHC में बनाए रखा. इन मामलों में, दाता सेल engraftment और HSC समारोह का निर्धारण करने के लिए मुश्किल हो सकता है के रूप में दाता विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों उपलब्ध नहीं हो सकता सकता है.
वाई गुणसूत्र विशिष्ट डीएनए जांच का प्रयोग करने के लिए सेक्स बेमेल अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण में दक्षिणी धब्बा द्वारा दाता पुरुष कोशिकाओं का पता लगाने के पहले डॉ. Miwa 6 समूह द्वारा विकसित किया गया था. फिर, एक क्षेत्र सेक्स निर्धारण वाई के लिए वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक सटीक और अति विशिष्ट मा quantitate विधि होना पाया गयामातृ रक्त 7 प्रणाली में ले भ्रूण कोशिकाओं. इस अवधारणा डॉ. Schwarzenberger समूह द्वारा एक murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में एक वास्तविक समय पीसीआर तकनीक दाता सेल engraftment 8 निर्धारित के विकास के लिए अनुकूलित किया गया था. हम आगे दाता / FVB NJ माउस अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल में सेल engraftment की माप के लिए इस विधि को संशोधित. इस विधि वर्तमान में बड़े पैमाने पर HSC जीव विज्ञान में Pim1 kinase की भूमिका का अध्ययन करने के लिए हमारे समूह में उपयोग किया.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य के लिए दर्शकों को एक पीसीआर आधारित एक प्रतिस्पर्धी murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में दाता सेल engraftment यों तकनीक प्रदान करने के लिए है. कई अध्ययनों RT-पीसीआर प्रत्यार?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने वास्तविक समय पीसीआर मशीन के उपयोग के लिए डॉ. चार्ल्स Greenberg धन्यवाद. यह काम MUSC Hollings कैंसर केंद्र स्टार्टअप फंड, Hollings कैंसर केंद्र ACS IRG, ASCO जीतना कैंसर फाउंडेशन कैरियर विकास पुरस्कार, एनआईएच +१,०३,७८० 01A1 1K08HL, और 3P30CA138313-01S3 NIH द्वारा समर्थित है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और स्वास्थ्य या अन्य वित्तपोषण एजेंट के राष्ट्रीय संस्थानों के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
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