השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד
Summary
RPPA מאפשר ביטוי החלבונים של מאה דגימות, שהודפסו בשקופיות ניטרוצלולוזה לחקירה בו זמנית, תוך שימוש בנוגדנים שכותרתו fluorescently. טכניקה זו יושמה כדי לבחון את ההשפעה של טיפול תרופתי בהטרוגניות קרצינומה של תאים של כליה ברורה.
Abstract
כיום לא קיים טיפול מרפא לטיפול בסרטן גרורתי של תאי הכליה ברור תא, הגרסה הנפוצה ביותר של המחלה. גורם מרכזי בעמידות לטיפול זה נחשב למורכבות המולקולרית של המחלה 1. טיפול ממוקד כגון מעכבי טירוזין קינאז (TKI)-sunitinib כבר נוצל, אבל רק 40% מחולים יגיבו, עם הרוב המכריע של חולים אלו התקפיים בתוך שנת 1 2. כפי השאלה כזו של התנגדות פנימית ורכש בחולי סרטן תאי כליה היא רלוונטית מאוד 3.
כדי ללמוד התנגדות לTKIs, עם המטרה הסופית של פיתוח טיפולים יעילים ומותאם אישית, רקמה רציפה לאחר תקופה מסוימת של טיפול ממוקד היא חובה, גישה שהוכיחה את הצלחתה ב4 לוקמיה מיאלואידית כרוניות. עם זאת יישום של אסטרטגיה כזו בקרצינומה של תאי כליות הוא מסובך בשל הרמה הגבוהה של both ההטרוגניות ובין intratumoral, בו היא תכונה של קרצינומה של תאים של כלית 5,6, כמו גם גידולים מוצקים אחרים 7. ההטרוגניות Intertumoral בשל הבדלים גנטיים transcriptomic ומבוססת היטב גם בחולים עם מצגת דומה, שלב ודרגה של גידול. בנוסף ברור שיש הטרוגניות רבה המורפולוגי (intratumoral) בRCC, שעשוי לייצג את ההטרוגניות מולקולרית גדולה עוד יותר. מיפוי וסיווג מפורט של גידולי RCC ידי ניתוח צורני משולב ודירוג Fuhrman מאפשרים בחירה של אזורים יציגים לניתוח proteomic.
ניתוח מבוסס חלבון של RCC 8 הוא אטרקטיבי בשל הזמינות הנרחבת שלה במעבדות פתולוגיה, עם זאת, יישומה עלול להיות בעייתי בשל הזמינות המוגבלת של נוגדנים ספציפיים 9. בשל אופי נקודת הכתם של מערכי חלבון השלב ההפוכים (RPPA), סגולי נוגדנים ב חובהדואר מראש תוקף; כבקרת איכות קפדנית כל כך של נוגדנים המשמשים הוא בעלת חשיבות עליונה. למרות מגבלה זו פורמט כתם הנקודה אינו מאפשר מזעור assay, המאפשר הדפסה של מאה דגימות לשקופית ניטרוצלולוזה אחת. שקופיות מודפסות אז ניתן לנתח באופן דומה לניתוח מערבי עם השימוש בנוגדני היעד ספציפיים עיקריים ונוגדנים משניים שכותרתו fluorescently, המאפשרות ריבוב. ביטוי חלבון הפרש בכל הדגימות בשקופית אז ניתן לנתח בו זמנית על ידי השוואת הרמה היחסית של קרינה באופן יעיל, חסכוניים יותר ותפוקה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת RPPA מוצגת כאן מייצגת אלטרנטיבת תפוקה גבוהה לשימוש נרחב, אך נמוכה יחסית טכניקת הכתם מערבי תפוקה של ניתוח חלבון. השיטה מאפשרת מאת דגימות להיות חצי כמותית נתחו והשוואה בו זמנית מאפשר השוואה ישירה של חלבוני מפתח במגוון רחב של שורות תאים ודגימות רקמה. ריבוב עם מיני נו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה של סופרי FCO, DF, י"נ, DJH וGDS הוזכרה לעיל ממומן על ידי משרד המדען הראשי, מספר מענק: ETM37 ונתמך על ידי המרכז לחקר הסרטן בבריטניה הניסויית סרטן הרפואה. עבודתו של אל ממומנת על ידי מכללת מנתחים המלכותית של אדינבורו רוברטסון נאמנות, מלוויל הנאמנות לטיפול והריפוי של הסרטן והמועצה למחקר הרפואי. IO נתמך על ידי אגודה מלכותית למלגת ממשלת סקוטלנד אדינבורו cofunded פעולות Curie מארי ובריטניה המועצה למחקר הרפואי. המחברים מבקשים להודות לעמיתים ולמשתפי פעולה SCOTRRCC מועמדים לדיונים השימושיים שלהם על חלק מהנושאים שנדונו במאמר זה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
