Anvendelse af omvendt fase-protein Arrays (RPPA) at udforske Protein Expression Variation i de enkelte renalcellecarcinom Kræft
Summary
RPPA muliggør protein ekspression af hundreder af prøver, udskrives på nitrocellulose objektglas til at blive udspurgt samtidigt under anvendelse af fluorescensmærkede antistoffer. Denne teknik er blevet anvendt til at studere virkningen af lægemiddelbehandling heterogenitet inden clear cell renal carcinoma.
Abstract
I øjeblikket er der ingen helbredende behandling for metastatisk clear cell renal cell cancer, den hyppigste variant af sygdommen. En vigtig faktor for denne behandling modstand menes at være den molekylære kompleksitet af sygdommen 1. Målrettet terapi såsom tyrosinkinasehæmmer (TKI)-sunitinib er blevet anvendt, men kun 40% af patienterne vil reagere, med et overvældende flertal af disse patienter fik tilbagefald inden for 1 år 2. Som sådan spørgsmålet om iboende og erhvervet resistens i nyrecellecancer patienter er yderst relevant 3.
For at studere modstand mod TKIs, med det ultimative mål at udvikle effektive, personlige behandlinger, er sekventiel væv efter en bestemt periode med målrettet terapi er påkrævet, en tilgang, der havde været en succes i kronisk myeloid leukæmi 4. Men anvendelsen af en sådan strategi i renalcellecarcinom kompliceres af det høje niveau af bOTH inter-og intratumoral heterogenitet, der er en funktion af renalcellecarcinom 5,6 samt andre faste tumorer 7. Intertumoral heterogenitet skyldes transkriptomisk og genetiske forskelle er veletableret selv hos patienter med lignende præsentation, stadium og kvalitet af tumor. Desuden er det klart, at der er stor morfologisk (intratumoral) heterogenitet i RCC, som kan repræsentere endnu større molekylær heterogenitet. Detaljeret kortlægning og kategorisering af RCC tumorer ved kombineret morfologisk analyse og Fuhrman grading tillader valg af repræsentative områder for proteom analyse.
Protein baseret analyse af RCC 8 er attraktiv på grund af sin udbredte tilgængelighed i patologi laboratorier, men kan det i princippet være problematisk på grund af den begrænsede tilgængelighed af specifikke antistoffer 9. På grund af dot blot arten af omvendt fase Protein Arrays (RPPA), antistofspecificitet skal be prævalideret, som sådan en streng kvalitetskontrol af de anvendte antistoffer er af afgørende betydning. På trods af denne begrænsning af dot blot-format tillader, assay miniaturisering, der giver mulighed for trykning af hundredvis af prøver på et enkelt nitrocellulose slide. Trykte objektglas kan derefter analyseres på lignende måde til Western-analyse med anvendelse af mål-specifikke primære antistoffer og fluorescensmærkede sekundære antistoffer, der giver mulighed for multipleksering. Differential proteinekspression i alle prøverne på et objektglas kan derefter analyseres samtidigt ved at sammenligne det relative niveau af fluorescens på en mere omkostningseffektiv og højt gennemløb måde.
Protocol
Representative Results
Discussion
The RPPA metode præsenteres her repræsenterer en high throughput alternativ til den udbredte, men forholdsvis lille produktion western blot teknik proteinanalyse. Fremgangsmåden tillader hundreder af prøver at være semi-kvantitativt analyseret og sammenlignet samtidig giver mulighed for direkte sammenligning af vigtige proteiner over et bredt udvalg af cellelinjer og vævsprøver. Multipleksering med forskellige antistofarter yderligere øger effekten af teknikken tillader flere antistoffer, som anvendes samt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet af forfattere FCO, DF, JN, DJH og GDS ovennævnte er finansieret af Chief Scientist Office, tilskud nummer: ETM37 og støttet af Cancer Research UK Forsøgscenter Cancer Medicin Centre. Arbejdet i AL er finansieret af Royal College of Surgeons i Edinburgh Robertson Trust, Melville Trust for pleje og helbredelse af kræft og Medical Research Council. IO er understøttet af en Royal Society of Edinburgh skotske regering Fellowship samfinansieres af Marie Curie-aktiviteterne og det britiske Medical Research Council. Forfatterne vil gerne takke SCOTRRCC medansøgere og samarbejdspartnere for deres nyttige drøftelser om nogle af de diskuterede emner i dette papir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
