Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers
Summary
RPPA kan de eiwitexpressie van honderden monsters gedrukt op nitrocellulose dia gelijktijdig worden uitgelezen met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Deze techniek is toegepast om het effect van medicamenteuze behandeling heterogeniteit studeren in clear cell niercarcinoom.
Abstract
Op dit moment is er geen curatieve behandeling voor gemetastaseerd clear cell niercelcarcinoom, de meest voorkomende variant van de ziekte. Een belangrijke factor in deze behandeling weerstand gedacht dat de moleculaire complexiteit van de ziekte 1 zijn. Gerichte therapie zoals tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib zijn gebruikt, maar slechts 40% van de patiënten, reageren met de overgrote meerderheid van deze patiënten relapsing binnen 1 jaar 2. Als zodanig de vraag intrinsieke en verworven resistentie in niercelkanker patiënten is zeer relevant 3.
Met het oog op resistentie tegen studeren TKI's, met als uiteindelijk doel het ontwikkelen van efficiënte en gepersonaliseerde behandelingen, wordt sequentiële weefsel na een bepaalde periode van gerichte therapie nodig, een aanpak die succesvol was gebleken bij chronische myeloïde leukemie 4. Echter, de toepassing van een dergelijke strategie niercelcarcinoom wordt bemoeilijkt door de hoge both inter-en intratumorale heterogeniteit, wat een kenmerk is van niercelcarcinoom 5,6 en andere vaste tumoren 7. Intertumoral heterogeniteit als gevolg van transcriptoom-en genetische verschillen is goed ingeburgerd, zelfs bij patiënten met een soortgelijke presentatie, stadium en de graad van de tumor. Bovendien is het duidelijk dat er grote morfologische (intratumorale) heterogeniteit in RCC, die waarschijnlijk nog grotere moleculaire heterogeniteit vertegenwoordigen. Gedetailleerd in kaart brengen en categoriseren van RCC tumoren door gecombineerde morfologische analyse en Fuhrman indeling maakt het mogelijk de selectie van representatieve gebieden voor proteomische analyse.
Eiwit analyse van RCC 8 is aantrekkelijk vanwege de algemene beschikbaarheid in pathologische laboratoria, maar de toepassing ervan kan problematisch vanwege de beperkte beschikbaarheid van specifieke antilichamen 9. Als gevolg van de dot-blot aard van de omgekeerde fase eiwitseries (RPPA), antilichaam de specificiteit moeten be geprevalideerde en als zodanig strenge kwaliteitscontrole van de gebruikte antilichamen is van het grootste belang. Ondanks deze beperking de dot blot format, dat de mogelijkheid assay miniaturisatie, waardoor het drukken van honderden monsters op een nitrocellulose dia. Afgedrukte dia kan vervolgens worden geanalyseerd op soortgelijke wijze als Western-analyse met behulp van doelspecifieke primaire antilichamen en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, waardoor multiplexing. Differentiële eiwitexpressie in alle monsters op een dia kunnen dan tegelijkertijd worden geanalyseerd door het relatieve fluorescentie in een kosteneffectieve en high-throughput manier.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methode RPPA is een high throughput alternatief voor de veel gebruikte maar relatief lage doorzet western blot techniek eiwitanalyse. De werkwijze maakt honderden monsters te semi-kwantitatief geanalyseerd en vergeleken gelijktijdig waardoor directe vergelijking van de belangrijkste eiwitten in een brede selectie van cellijnen en weefselmonsters. Multiplexing met verschillende antistofspecies verder vergroot het vermogen van de techniek die meerdere antilichamen gelijktijdig worden gebruikt. De hi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk van auteurs FCO, DF, JN, DJH en GDS hierboven genoemde wordt gefinancierd door de Chief Scientist Office, subsidie-nummer: ETM37 en ondersteund door het Cancer Research UK Experimenteel Kankeronderzoek Geneeskunde Centrum. Het werk van AL wordt gefinancierd door de Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, de Melville Trust voor de verzorging en genezing van kanker en de Medical Research Council. IO wordt ondersteund door een Royal Society of Edinburgh Schotse regering Fellowship medegefinancierd door Marie Curie-acties en het Verenigd Koninkrijk Medical Research Council. De auteurs willen graag SCOTRRCC mede-aanvragers en medewerkers bedanken voor hun nuttige discussies op een aantal van de onderwerpen die in dit document.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
