Der Einsatz von Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) an Protein Expression Variation innerhalb der einzelnen Renal Cell Cancers erkunden
Summary
RPPA ermöglicht die Proteinexpression von Hunderten von Proben auf Nitrozellulose Folien gedruckt, um gleichzeitig abgefragt werden, mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Diese Technik angewendet worden ist, um die Wirkung der medikamentösen Behandlung Heterogenität innerhalb klarzelligen Nierenkarzinom studieren.
Abstract
Derzeit gibt es keine kurative Behandlung für metastasierten klarzelligen Nierenzellkarzinoms, der häufigsten Variante der Krankheit. Ein wichtiger Faktor in diesem Therapieresistenz wird gedacht, um die molekulare Komplexität der Erkrankung 1 sein. Gezielte Therapie wie die Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI)-Sunitinib genutzt wurden, aber nur 40% der Patienten reagieren, mit der überwältigenden Mehrheit dieser Patienten schubförmig innerhalb von 1 Jahr 2. Als solche ist die Frage der intrinsischen und erworbenen Resistenz in Nierenzellkrebskranken ist höchst relevant 3.
Um den Widerstand gegen TKI zu studieren, mit dem Ziel der Entwicklung wirksamer, individuell abgestimmte Behandlungen wird sequentielle Gewebe nach einer bestimmten Zeit der gezielten Therapie erforderlich, ein Konzept, das sich bewährt bei chronischer myeloischer Leukämie 4 hatte. Doch die Anwendung einer solchen Strategie in Nierenzellkarzinom ist durch das hohe Niveau der b kompliziertoth inter-und intratumorale Heterogenität, die ein Merkmal des Nierenzellkarzinoms 5,6 sowie anderen soliden Tumoren 7 ist. Intertumoral Heterogenität aufgrund der Transkriptom-und genetische Unterschiede ist gut, auch bei Patienten mit ähnlichen Präsentation, Stadium und Grad des Tumors festgestellt. Darüber hinaus ist es klar, dass es große morphologische (intratumorale) Heterogenität in RCC, die wahrscheinlich noch größere molekulare Heterogenität repräsentieren. Detaillierte Kartierungen und Kategorisierung von RCC Tumoren durch kombinierte morphologische Analyse und Fuhrman Einstufung ermöglicht die Auswahl von repräsentativen Flächen für Proteomanalyse.
Protein-basierte Analyse der RCC 8 ist attraktiv wegen seiner breiten Verfügbarkeit in Pathologie-Laboratorien, aber ihre Anwendung problematisch sein kann aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern 9. Aufgrund der Dot-Blot Art der Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), Antikörper-Spezifität muss be vorvalidierten, als solche strengen Qualitätskontrolle von Antikörpern verwendet wird, ist von größter Bedeutung. Trotz dieser Einschränkung der Dot-Blot-Format nicht zulässt Assay Miniaturisierung, so dass für den Druck von Hunderten von Proben auf einen einzelnen Nitrocellulose Folie. Bedruckte Folien können dann in einer ähnlichen Weise wie Western-Analyse werden unter Verwendung von Ziel-spezifischen primären Antikörper und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper analysiert, so dass für Multiplexing. Differential Proteinexpression in allen Proben auf einer Folie kann dann gleichzeitig durch Vergleichen der relativen Pegel der Fluoreszenz in einer kostengünstigeren und Weise mit hohem Durchsatz untersucht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die RPPA hier vorgestellte Methode stellt einen hohen Durchsatz Alternative zu den weit verbreiteten, aber vergleichsweise geringen Durchsatz Western-Blot-Technik von Protein-Analyse. Das Verfahren erlaubt Hunderte von Proben werden semiquantitativ ausgewertet und gleichzeitig zur direkten Vergleich der wichtigsten Proteine in einem breiten Auswahl von Zelllinien und Gewebeproben. Multiplexen mit unterschiedlichen Antikörperspezies weiter erhöht die Leistung der Technik so dass mehrere Antikörper gleichzeitig e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit von Autoren FCO, DF, JN, DJH-und GDS erwähnt durch den Chief Scientist Office, Grantnummer finanziert wird: ETM37 und unterstützt von der Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre. Die Arbeit von AL wird von der Royal College of Surgeons of Edinburgh Robertson Trust, die Melville Vertrauen für die Pflege und Heilung von Krebs und dem Medical Research Council finanziert. IO wird durch ein Royal Society of Edinburgh Scottish Government Fellowship by Marie-Curie-Maßnahmen und der UK Medical Research Council kofinanziert unterstützt. Die Autoren möchten SCOTRRCC Mitantragsteller und Mitarbeitern für ihre nützlichen Diskussionen über einige der Themen in diesem Papier diskutiert danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
