L'uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine all'interno dei singoli tumori a cellule renali
Summary
RPPA consente l'espressione della proteina di centinaia di campioni, stampati su vetrini nitrocellulosa da interrogare simultaneamente, utilizzando fluorescente anticorpi. Questa tecnica è stata applicata per studiare l'effetto di eterogeneità farmaco nel trattamento carcinoma a cellule renali chiare.
Abstract
Attualmente non esiste alcun trattamento curativo per carcinoma a cellule chiare metastatico a cellule renali, il più comune variante della malattia. Un fattore chiave in questa resistenza trattamento è pensato per essere la complessità molecolare della malattia 1. La terapia mirata come l'inibitore della tirosin-chinasi (TKI), sunitinib sono stati utilizzati, ma solo il 40% dei pazienti risponde, con la stragrande maggioranza di questi pazienti recidivanti entro 1 anno 2. Come tale la questione della resistenza intrinseca e acquisita nei pazienti con carcinoma renale delle cellule è molto importante 3.
Al fine di studiare la resistenza a TKIs, con l'obiettivo finale di sviluppare efficaci, trattamenti personalizzati, tessuti sequenziale dopo un determinato periodo di terapia mirata è necessario, un approccio che ha avuto successo in quattro mieloide cronica leucemia. Tuttavia l'applicazione di tale strategia nel carcinoma renale è complicata dal livello di bOTH eterogeneità inter-e intratumorale, che è una caratteristica del carcinoma renale 5,6 e altri tumori solidi 7. Eterogeneità Intertumoral a causa delle differenze trascrittomica e genetico è ben definito anche nei pazienti con presentazione simile, stadio e grado del tumore. Inoltre, è chiaro che vi è grande morfologica (intratumorale) eterogeneità in RCC, che rischia di rappresentare ancora maggiore eterogeneità molecolare. Mappatura dettagliata e classificazione dei tumori RCC di combinata analisi morfologica e classificazione Fuhrman consente la selezione di aree rappresentative per l'analisi proteomica.
Analisi a base di proteine del RCC 8 è interessante per la sua ampia disponibilità in laboratori di patologia, ma la sua applicazione può essere problematico a causa della limitata disponibilità di anticorpi specifici 9. A causa della natura dot blot delle matrici Reverse proteina di fase (RPPA), specificità anticorpale deve be pre-validato, in quanto tale controllo di qualità rigoroso di anticorpi utilizzati è di fondamentale importanza. Nonostante questa limitazione, il formato dot blot non consentono miniaturizzazione dosaggio, consentendo la stampa di centinaia di campioni su un vetrino nitrocellulosa singola. Diapositive stampate possono poi essere analizzate in modo simile ad analisi Western con l'uso di anticorpi specifici obiettivi primari e contrassegnati in modo fluorescente anticorpi secondari, consentendo multiplexing. Proteina espressione differenziale in tutti i campioni di una diapositiva possono essere analizzati simultaneamente confrontando il livello relativo di fluorescenza in un modo più conveniente e ad alta produttività.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo RPPA qui presentato rappresenta una valida alternativa ad alta velocità per il ampiamente utilizzato, ma relativamente basso tecnica blot velocità occidentale di analisi delle proteine. Il metodo permette centinaia di campioni da semi-quantitativamente analizzato e confrontato simultaneamente consentendo confronto diretto delle proteine chiave attraverso un'ampia selezione di linee cellulari e campioni di tessuto. Multiplexing con diverse specie anticorpali aumenta ulteriormente la potenza della te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro di autori FCO, DF, JN, DJH e GDS di cui sopra è finanziato dall'Ufficio Chief Scientist, un numero di concessione: ETM37 e sostenuto dal Centro di Cancer Research UK Medicina sperimentale sul cancro. Il lavoro di AL è finanziato dal Royal College of Surgeons di Edimburgo Robertson, il trust Melville per la cura e la cura del cancro e del Medical Research Council. IO è sostenuto da una borsa di studio della Royal Society di Edimburgo governo scozzese cofinanziato Azioni Marie Curie e il Medical Research Council britannico. Gli autori desiderano ringraziare SCOTRRCC co-candidati e collaboratori per le loro discussioni utili su alcuni degli argomenti trattati in questo documento.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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