O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais
Summary
RPPA permite a expressão da proteína de centenas de amostras, impressos em lâminas de nitrocelulose para serem interrogados ao mesmo tempo, utilizando anticorpos marcados com fluorescência. Esta técnica tem sido utilizada para estudar o efeito do tratamento com medicamentos na heterogeneidade claro carcinoma de células renais.
Abstract
Actualmente não existe tratamento curativo para cancro metastático da célula clara de células renais, o mais comum dos variante da doença. Um factor chave neste resistência ao tratamento é considerado a complexidade molecular da doença 1. Terapia-alvo, tais como o inibidor da tirosina cinase (TKI)-sunitinib têm sido utilizados, mas apenas 40% dos pacientes respondem, com a grande maioria destes pacientes recidivantes dentro de 1 ano 2. Como tal a questão da resistência intrínseca e adquirida em pacientes com câncer de células renais é altamente relevante 3.
Para estudar a resistência a inibidores da tirosina quinase, com o objetivo final de desenvolver tratamentos eficazes e personalizados, tecido seqüencial após um período específico de terapia-alvo é necessária, uma abordagem que tinha sido bem sucedida em mielóide crônica 4 leucemia. No entanto, a aplicação de uma tal estratégia em carcinoma de células renais é complicada pelo elevado nível de both heterogeneidade inter-e intra-tumoral, o que é uma característica do carcinoma de células renais, 5,6, assim como outros tumores sólidos 7. Heterogeneidade Intertumoral devido a diferenças transcriptomic e genética está bem estabelecido, mesmo em pacientes com apresentação semelhante, estágio e grau do tumor. Além disso, é evidente que existe uma grande heterogeneidade (intratumoral) morfológica no RCC, a qual é susceptível de representar ainda maior heterogeneidade molecular. Mapeamento detalhado e classificação de tumores CCR por análise morfológica e classificação combinada Fuhrman permite a seleção de áreas representativas para análise proteômica.
Análise de proteínas baseada em 8 RCC é atraente devido a sua ampla disponibilidade em laboratórios de patologia, no entanto, a sua aplicação pode ser problemática devido à disponibilidade limitada de anticorpos específicos 9. Devido à natureza dot blot dos arrays de proteínas, em fase reversa (RPPA), a especificidade do anticorpo deve be pré-validado, como o controlo de qualidade rigoroso de tais anticorpos utilizados é de importância primordial. Apesar desta limitação, o formato dot blot não permite a miniaturização do ensaio, permitindo a impressão de centenas de amostras para uma lâmina de nitrocelulose único. Slides impressos podem então ser analisadas de uma forma semelhante à análise de Western com o uso de alvos específicos anticorpos primários e anticorpos secundários marcados com fluorescência, permitindo a multiplexagem. A expressão diferencial de proteínas em todas as amostras numa lâmina pode então ser analisados simultaneamente através da comparação do nível relativo de fluorescência de uma forma mais rentável e de alto rendimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado RPPA representa uma alternativa para a produção elevada amplamente utilizada mas comparativamente baixa taxa de transferência western blot técnica de análise de proteínas. O método permite que centenas de amostras para ser semi-quantitativamente analisadas e comparadas simultaneamente permitindo a comparação directa de proteínas-chave através de uma grande variedade de linhas celulares e amostras de tecido. Multiplexagem com espécies diferentes de anticorpos aumenta ainda mais o po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho dos autores FCO, DF, JN, DJH e GDS mencionado acima é financiado pelo Escritório Cientista Chefe, número de concessão: ETM37 e apoiado pelo Reino Unido Centro de Pesquisa do Câncer Medicina Experimental do Câncer. O trabalho de AL é financiado pelo Royal College of Surgeons de Edinburgh Robertson Trust, o Confiança Melville para o cuidado ea cura do câncer e do Conselho de Pesquisa Médica. IO é apoiado por uma Sociedade Real de Edimburgo Fellowship Governo escocês co-financiado pelas Acções Marie Curie e do UK Medical Research Council. Os autores gostariam de agradecer SCOTRRCC co-candidatos e colaboradores para suas discussões úteis sobre alguns dos temas abordados neste trabalho.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
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