Il<em> Citrobacter rodentium</em> Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva
Summary
Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.
Abstract
Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di malattie infettive e colite, così come i metodi utilizzati per caratterizzare Citrobacter rodentium infezione nei topi. C. rodentium è un batterio gram negativo, murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla clinicamente importante enteropatogeno E. umana patogeni coli e E. enteroemorragica coli. Dopo infezione con C. rodentium, topi immunocompetenti soffrono di perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Istologicamente, allungamento cripta intestinale, infiltrazione di cellule immunitarie, e la deplezione delle cellule calice si osservano. Liquidazione di infezione è raggiunto dopo 3 o 4 settimane. Misurazione della barriera epiteliale intestinale integrità, carica batterica, e danno istologico a tempi diversi dopo l'infezione, consentono la caratterizzazione dei ceppi di topi suscettibili all'infezione.
Il meccanismo di virulenzas con il quale batteri patogeni colonizzano il tratto intestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici che difendono contro le infezioni siano poco conosciuti. Pertanto l'C. rodentium modello di infezione batterica enterica è uno strumento prezioso per aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi visti in pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici. Pertanto, lo studio di modelli di colite infettiva offre un notevole potenziale per la definizione di risposta dell'ospite potenzialmente patogeni per i batteri enterici. C. rodentium colite indotta da uno di questi modelli è raro che permette l'analisi delle risposte di accoglienza per i batteri enterici, la nostra comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD;essenziale nello sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.
Introduction
Infezione da batteri patogeni enterici innesca gastrointestinale (GI) infiammazione, nonché intestinale patologia e fisiopatologia, incluse diarrea e disfunzione barriera epiteliale intestinale. I meccanismi di virulenza di batteri patogeni che colonizzano il tratto gastrointestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici per difendersi contro tali infezioni sono poco conosciuti, ma recenti progressi nella modellazione di enterici infezioni batteriche hanno iniziato ad aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). La malattia di Crohn malattie infiammatorie dell'intestino (CD) e UC sono malattie complesse di eziologia sconosciuta, caratterizzata da infiammazione cronica intestinale e danni ai tessuti. Molti modelli murini di infiammazione intestinale esistono, da infiammazione spontanea in ceppi geneticamente modificati, come IL10 – / – topi, alle sfide con composti chimici, come destrano solfato sodico (DSS) e dinitrobenzene solfonico (DNBS) 1. È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi presenti nei pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici 2, quindi lo studio dei modelli di colite infettiva offre anche notevoli potenzialità per definire potenzialmente patogeni ospitante . risposte a batteri enterici Citrobacter rodentium colite indotta è uno dei pochi modelli di colite infettiva che è stata ben caratterizzata 1,3, consentendo l'analisi delle risposte dell'ospite ai batteri enterici e ulteriore comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD; un passo essenziale per lo sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.
C. rodentium è un gram negativo fissaggio e effacing (A / E), murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla umana importantepatogeni enteropatogeno E. coli (EPEC) e enteroemorragica E. coli (EHEC) 3-8. La famiglia di una patogeni / E intimamente collegare alla membrana apicale della cellula ospite dell'epitelio cecale e colon, formando un non-invasiva piedistallo struttura simile sulla cellula ospite. Sfida orale con C. rodentium di 10 8 -10 9 organismi produce un robusto modello di colite infettiva caratterizzata da iperplasia del colon o allungamento delle cripte, infiltrazione di cellule mononucleate immunitario e deplezione delle cellule calice 3,4. Il sito iniziale di colonizzazione, poche ore dopo la sfida, è la patch cieco, seguita dalla progressione verso il colon distale 2 o 3 giorni dopo l'infezione 3. In ceppi di topi immunocompetenti, la clearance del patogeno viene raggiunto 3 a 4 settimane dopo l'infezione 1,3,4. Tuttavia, molti ceppi geneticamente modificati, cioè gene carente o knockout (- / -) topi, sono stati trovati per visualizzare Increased suscettibilità alle infezioni con conseguenti danni esagerato e / o infezione e infiammazione cronica 9-14. L'utilizzo di questo modello di colite infettiva in questi ceppi ad eliminazione diretta, molti mancano innate proteine di segnalazione, è stato indispensabile nel rivelare proteine ospite diverse integrali alla risoluzione di infezione intestinale e l'infiammazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per lo studio di entrambi malattie infettive e colite nei topi. Questo modello unico consente la caratterizzazione di entrambe le risposte dell'ospite, come pure le proprietà di batteri patogeni. La procedura descritta in questo particolare protocollo il successo nell'uso di questo modello.
Ci sono diversi passaggi critici di questo protocollo da tenere a mente quando si induce la colite e l'analisi del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di funzionamento a BAV dal morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC) e degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR). GB è stato finanziato da una borsa di studio laureato CIHR. BAV sono i bambini con disturbi intestinali e del fegato (BAMBINO) presidente della Fondazione di Ricerca Pediatrica IBD e il Canada Research Chair in Gastroenterologia Pediatrica.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
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