<em> Citrobacter rodentium</em> Mouse Model: изучение патогенности и Хост Взносы в инфекционным колитом
Summary
Citrobacter rodentium инфекции предоставляет ценную модель для изучения кишечных бактериальных инфекций, а также иммунный ответ и колита у мышей. Этот протокол описывает измерение барьер целостности, патогенов и гистологическое повреждение позволяет тщательно характеристика возбудителя и принимающих вклады в мышиной инфекционных колитах.
Abstract
Этот протокол описывает шаги, необходимые для создания надежной модели инфекционного заболевания и колитах, а также методы, используемые для характеристики Citrobacter rodentium инфекции у мышей. C. rodentium представляет собой грамотрицательные, мышиный конкретных бактериальных патогенов, которые тесно связаны с клинически значимых патогенов человека энтеропатогенных E. палочки и Энтерогеморрагическая E. палочки. После инфицирования C. rodentium, иммунокомпетентных мышей страдают от скромных и переходные потери веса и диареи. Гистологически, кишечных удлинение склеп, иммунной клеточной инфильтрации и истощения бокаловидных клеток не наблюдается. Оформление инфекции достигается после 3 до 4 недель. Измерение кишечного эпителия целостности барьера, бактериальной нагрузки, и гистологическое повреждение в различные моменты времени после заражения, позволяющие характеристика штаммов мыши восприимчивы к инфекции.
Механизм вирулентностис помощью которых патогенные бактерии колонизировать желудочно-кишечного тракта их хозяев, а также конкретные ответы хоста, защититься от таких инфекций мало изучены. Поэтому C. rodentium модели кишечной бактериальной инфекции служит ценным инструментом, чтобы помочь в нашем понимании этих процессов. Кишечные бактерии также были связаны с Воспалительные заболевания кишечника (IBDs). Она была выдвинута гипотеза о том, что неадекватные хронические воспалительные реакции наблюдаются у пациентов IBD развиваются у генетически предрасположенных лиц после ненормального воздействия на слизистой кишечника иммунной системы кишечных бактерий. Таким образом, изучение моделей инфекционного колита имеет значительный потенциал для определения потенциально патогенных ответы принимающей кишечных бактерий. C. rodentium индуцированный колит является одним из таких редких моделей, что позволяет проводить анализ принимающих ответы на кишечные бактерии, углубления нашего понимания возможных механизмов патогенеза IBD;важную роль в разработке новых профилактических и лечебных процедур.
Introduction
Заражение кишечными бактериальными патогенами вызывает желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) воспаления, а также кишечной патологии и патофизиологии, в том числе диарея и кишечные эпителиальные дисфункции барьера. Вирулентности механизмы, с помощью которых патогенные бактерии колонизировать желудочно-кишечного тракта их хозяев, а также конкретные ответы хоста, защититься от таких инфекций, плохо понимается, однако последние достижения в области моделирования кишечных бактериальных инфекций начали помогать нашему пониманию этих процессов. Кишечные бактерии также были связаны с Воспалительные заболевания кишечника (IBDs). Болезнь IBDs Крона (БК) и UC являются сложными заболеваниями неизвестной этиологии, характеризующееся хроническим кишечным воспалением и повреждением тканей. Многие модели мыши кишечного воспаления существуют, от спонтанного воспаления у генетически модифицированные штаммы, такие как IL10 – / – мышей, химических проблем с соединениями, такими как декстран сульфат натрия (DSS) и гinitrobenzene кислоты (DNBS) 1. Она была выдвинута гипотеза о том, что неадекватные хронических воспалительных реакций присутствует у пациентов IBD развиваются у генетически предрасположенных лиц по ненормального воздействия на слизистой кишечника иммунной системы кишечных бактерий 2, поэтому исследование модели инфекционного колита также имеет значительный потенциал для определения потенциально патогенных хоста . ответы на кишечные бактерии Citrobacter rodentium индуцированный колит является одним из самых редких моделей инфекционных колитах, которые были охарактеризованы 1,3, что позволяет при анализе ответов на множество кишечных бактерий и дальнейшего понимания возможных механизмов патогенеза IBD; важным шагом В разработке новых профилактических и лечебных процедур.
C. rodentium является грамотрицательные крепления и скромный (A / E), мышиный конкретных бактериальных патогенов, которые тесно связаны с важными человекапатогенных энтеропатогенных E. палочка (EPEC) и энтерогеморрагическая E. палочка (EHEC) 3-8. Семейство / E патогенных тесно приложить к апикальной мембране клетки-хозяина из слепой кишки и ободочной эпителия, образуя неинвазивной пьедестал подобные структуры на клетке-хозяине. Устные проблема с C. rodentium из 10 8 -10 9 организмов создает надежную модель инфекционного колита характеризуется толстой гиперплазии или удлинение склепы, мононуклеарными иммунной клеточной инфильтрации и бокаловидных клеток истощения 3,4. Начальный участок колонизации, за несколько часов после заражения, находится в слепой патч, затем прогрессии дистального отдела толстой кишки от 2 до 3 дней после заражения 3. В иммунокомпетентных линий мышей, оформление возбудителя осуществляется от 3 до 4 недель после заражения 1,3,4. Тем не менее, многие генетически модифицированные штаммы, т.е. ген недостаточной или нокаут (- / -) мышей, были найдены просмотров increaСЭД восприимчивость к инфекции в результате преувеличенного ущерба и / или хронической инфекцией и воспалением 9-14. Использование этой модели инфекционного колита в этих нокаутом штаммов, многие не хватает врожденной сигнальных белков, был незаменимым в выявлении нескольких белков, принимающих неотъемлемой разрешения кишечной инфекции и воспаления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium инфекции предоставляет ценную модель для изучения как инфекционные болезни и колитов у мышей. Эта уникальная модель позволяет для характеристики как хозяин ответы, а также патогенных свойств бактерий. Действия, описанные в этом протоколе подробно успешного использов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами для операционных BAV от Крона и колит фонда Канады (CCFC) и Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). ГБ была профинансирована выпускников аспирантуры с CIHR. BAV это дети с кишечными и заболеваний печени (CHILD) Председатель Фонда исследований в педиатрии IBD и Канада заведующая кафедрой в детской гастроэнтерологии.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
