Summary

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

Published: June 21, 2013
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Summary

La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.

Abstract

La reconstitución de los canales iónicos en las membranas de lípidos definidos químicamente para registro electrofisiológico ha sido una técnica poderosa para identificar y explorar la función de estas importantes proteínas. Sin embargo, las preparaciones clásicas, tales como bicapas planas, limitan las manipulaciones y experimentos que se pueden realizar en el canal reconstituido y su entorno de la membrana. La estructura más como una celda de liposomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionales sin sacrificar el control del medio ambiente de lípidos.

Electroformation es un medio eficiente para producir liposomas gigantes> 10 micras de diámetro que se basa en la aplicación de una tensión alterna a una, película de lípido ordenada delgada depositada sobre una superficie de electrodo. Sin embargo, ya que el protocolo clásico llama para los lípidos para ser depositados a partir de disolventes orgánicos, no es compatible con proteínas de la membrana menos robustos como canales de iones y debe ser modificado. Recientemente, protocols se han desarrollado para electroform liposomas gigantes de pequeños liposomas parcialmente deshidratadas, que hemos adaptado a los liposomas que contienen proteínas en nuestro laboratorio.

Presentamos aquí el fondo, equipo, técnicas, y las trampas de electroformation de liposomas gigantes de pequeñas dispersiones de liposomas. Comenzamos con el protocolo clásico, que debe ser dominado primero antes de intentar los protocolos más desafiantes que siguen. Se demuestra el proceso de deshidratación parcial controlada de pequeños liposomas usando equilibrio vapor con soluciones saturadas de sal. Por último, demostrar el propio proceso de electroformation. Vamos a describir un equipo simple, de bajo costo que se puede hacer en casa para producir liposomas de alta calidad, y describir la inspección visual de la preparación en cada etapa para garantizar los mejores resultados.

Introduction

Liposomas gigantes (a menudo llamado vesículas unilamelares gigantes, o Guvs) principalmente se han utilizado para estudiar la física y la química física de bicapas de lípidos, incluyendo los estudios de deformación bicapa, la coexistencia fase lateral ("balsas"), la fusión de membranas, etc 1-4. Tienen una estructura groseramente similar a la célula: cáscara esférica de la membrana que rodea un interior acuoso que puede ser fácilmente hecho diferente que el tampón acuoso circundante. Ellos son, por definición, ≈ 1-100 micras de diámetro, por lo que se pueden obtener imágenes usando una variedad de enfoques de microscopía de luz. Pueden ser hechos tensa el uso de gradientes osmóticos o tensión aplicada mecánicamente, de modo que mientras que generalmente suave, sus propiedades pueden ser manipuladas para un fácil manejo. En particular, el control de la "rigidez" del liposoma hace que sea fácil para formar parches "liposomas adjuntos" o extirpado para electrofisiología. En el pasado, la reconstitución canal de iones se llevó a cabo en gran medida en los lípidos plana bilayers. Ahora, la capacidad para formar parches de liposomas gigantes y utilizar la considerable carcaj de herramientas desarrolladas para electrofisiología convencional (microscopía de fluorescencia, micropipeta de aspiración, la perfusión rápida y control de la temperatura, etc) hace que los liposomas gigantes cada vez más atractivo para los estudios de reconstitución de 5,6.

Liposomas gigantes han hecho muchas estrategias. De hecho, los liposomas gigantes se forman espontáneamente por un proceso de hinchamiento cuando una película de lípido seca se rehidrata 4,7,8. El deseo de preparar más rápidamente más grande, liposomas más uniformes llevó a los investigadores a otros enfoques, entre los que electroformation 1,9. Electroformation también se basa en la hidratación de una película lipídica seca, pero acelera el proceso a través de la aplicación de un campo eléctrico oscilante a través de la película de lípido. El campo se aplica a través de dos electrodos, ya sea en alambres de platino o de indio-estaño-óxido (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertos, separados por el agua otampón y en la que los lípidos se depositan. Al acelerar la hinchazón de los liposomas, se logra un mayor rendimiento de los liposomas más grandes. Por lo tanto, electroformation ha convertido en el método por defecto para producir liposomas gigantes 4.

El mecanismo de electroformation no se entiende completamente, y la mayoría de los protocolos se han desarrollado empíricamente (por ejemplo, 10,11). Sin embargo, podemos aprender un poco acerca de lo que puede esperar teniendo en cuenta la teoría y algunos resultados empíricos. La opinión generalizada es que electroformation se produce por la conducción del flujo electro-osmótico de amortiguación entre las bicapas lipídicas individuales apiladas en la película de lípidos depositados 10,11. Acoplamiento electrostático a las fluctuaciones térmicas de la bicapa lipídica es probable que también involucró 12. Estas hipótesis cualitativamente predicen los límites superiores de la frecuencia del campo eléctrico y la fuerza que se puede utilizar 10,12. En particular, se prevé que las soluciones de alta conductividad ( <eM> es decir, soluciones salinas fisiológicas) reducen las fuerzas electrohidrodinámicos que pueden iniciar la electroformation liposoma 12. Las tasas de flujo electroosmótico generalmente disminuyen con el aumento de la concentración de sal y se alcanzó su punto máximo con frecuencia a una frecuencia de oscilación del campo eléctrico (por ejemplo, si bien en una geometría diferente, Green et al. 13). Por lo tanto, las intensidades de campo más altas y frecuencias más altas son razonables para soluciones de alta conductividad, dentro de los límites 10.

Sin embargo, proteínas de la membrana es probable que sean incompatibles con el método habitual de depósito de lípidos en electrodos para el procedimiento electroswelling, a saber, en disolventes orgánicos que luego se evapora para dejar una película delgada de lípido. Hay dos rutas principales en torno a esta dificultad: para incorporar proteínas después de la formación de liposomas gigantes, o adaptar la forma en se depositan los lípidos. Nuestro enfoque se basa en otros 5,11 para depositar los lípidos y reconstitucióntuido proteína de membrana, junto a una suspensión de pequeñas o grandes "proteoliposomas". Se describe el largo y más difícil proceso de producción de proteoliposomas de proteínas y lípidos purificados en otro lugar (Collins y Gordon, en revisión). A continuación se describe el protocolo en ausencia de cualquier proteína, pero es lo mismo cuando se incorpora proteínas; incluimos los resultados muestran que proteoliposomas contienen el canal iónico TRPV1 se pueden transformar en GUVs y utilizados para patch-clamp electrofisiología. En cualquier enfoque electroformation, la inspección visual de la muestra de lípidos durante el proceso de deposición de lípidos es crítica para el éxito.

Nuestro enfoque puede ser relevante más allá de la aplicación especializada para la reconstitución canal de iones. En el tiempo desde que nos desarrollamos este protocolo y, ahora, también se ha demostrado que la forma en que los lípidos se depositan en los electrodos de electroformation afecta a la heterogeneidad de composición de los GUVs resultantes. Baykal-Caglar et. al 14 mostraron que GUVs cuidadosamente formados a partir de liposomas deshidratados tenían un 2,5 veces menor variación en la temperatura de transición miscibilidad de GUVs formados a partir de mezclas de diferentes fosfolípidos y colesterol. Su trabajo indica que los lípidos, y especialmente el colesterol, puede precipitar de la mezcla de lípidos cuando se depositan a partir de disolventes orgánicos, lo que resulta en una variación espacial en la composición de la película de lípido depositada. Esto es especialmente importante para los estudios de comportamiento de fase de lípidos de membrana, pero también puede ser crítico para experimentos cuantitativos en función del canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al. 'S es similar pero no idéntica a la nuestra, y se anima a los lectores a estudiar también.

Este protocolo (véase el resumen, la Figura 1) es uno de los muchos que se podría utilizar. En principio electroformation éxito depende de la mezcla de lípidos, la hidratación, la temperatura, otros solutos (especialmente iones), y dePor supuesto, el voltaje y la frecuencia utilizada en la formación. Como electroformation se entiende mejor, esperamos refinar nuestro protocolo más.

Por último, a menudo hay una pronunciada curva de aprendizaje en galvanoplastia liposomas gigantes. Sugerimos dominar el protocolo convencional (secciones 1 y 4, y de ser necesario, la Sección 5) antes de aprender a depositar los lípidos a partir de suspensiones de liposomas (Secciones 2-5).

Protocol

1. La deposición de lípidos a partir de disolventes orgánicos: Protocolo Clásica Eliminar los lípidos de almacenamiento a -20 ° C o -80 ° C; se calentó a TA Precaución:. Lípidos son extremadamente higroscópicos, y muchos son sensibles al oxígeno. Cubra lípidos en argón seco o nitrógeno gaseoso y en todos los pasos minimizar la exposición al aire. Si es necesario, suspender los lípidos en cloroformo o ciclohexano en mg / ml 1-10, tenga en cuenta que las conc…

Representative Results

En nuestros ejemplos, preparamos liposomas a partir de una mezcla de aproximadamente 55% en moles de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% en moles POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfoserina , 30 moles% de colesterol, y 0,1% en moles marcados con Rojo Texas 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composición fue elegido como representante de aproximadamente el ganglio de la raíz dorsal lípidos 18. Observamos que 15% en moles cargada lípidos …

Discussion

Electroformation de liposomas gigantes se ha convertido en una técnica flexible, compatible con diversos lípidos, preparaciones y tampones. El control cuidadoso del proceso de deposición de lípidos es más crítico para el éxito. Hemos presentado herramientas simples para hacer deposición controlada de los lípidos de las pequeñas preparaciones de liposomas un proceso sencillo. La humedad relativa es crítica a la deshidratación adecuada de los liposomas iniciales, y el valor óptimo variará con la concentraci?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Bryan Venema y Eric Martinson para construir el aparato electroformation. Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (R01GM100718 a SEG) y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01EY017564 a SEG).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Digital Multimeter Agilent Technologies, www.agilent.com U1232A or similar Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
  Fluke 117 or 177 Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator Agilent Technologies, www.agilent.com 33210A or similar Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com CB-90IN-S107 or similar Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com CNi3233 or similar  
Hygrometer Extech, Nashua, NH, www.extech.com 445815  
Silicone rubber sheet McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com 87315K64 Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket Laird Technologies www.lairdtech.com 4202-PA-51H-01800 or similar Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com T1395MP Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com 850457P or 850457C Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS Avanti Polar Lipids 840034P/C  
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667  

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Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (76), e50227, doi:10.3791/50227 (2013).

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