Préparation des liposomes de géant pour l'imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

Summary

La reconstitution de protéines membranaires fonctionnelles dans des liposomes géants de composition définie est une approche puissante lorsqu'elle est combinée avec l'électrophysiologie patch-clamp. Cependant, la production de liposome géant conventionnel peut être incompatible avec la stabilité des protéines. Nous décrivons les protocoles de production de liposomes géants de lipides purs ou des petits liposomes contenant des canaux ioniques.

Abstract

La reconstitution des canaux ioniques dans les membranes lipidiques chimiquement définis pour l'enregistrement électrophysiologique a été une technique puissante pour identifier et d'explorer la fonction de ces protéines importantes. Cependant, les préparations classiques, tels que les bicouches planaires, limiter les manipulations et expérimentations qui peuvent être effectuées sur le canal reconstitué et son environnement membranaire. La structure cellulaire plus comme des liposomes géants permet des expériences de patch-clamp traditionnels sans pour autant sacrifier le contrôle de l'environnement lipidique.

Électroformation est un moyen efficace pour produire des liposomes géants> 10 um de diamètre, qui repose sur l'application de la tension alternative d'un mince film lipidique ordonnée déposée sur une surface d'électrode. Toutefois, depuis le protocole classique appelle les lipides à déposer à partir de solvants organiques, il n'est pas compatible avec les protéines membranaires moins robustes comme les canaux ioniques et doit être modifié. Récemment, protocols ont été développés pour électroforme liposomes géants de petits liposomes partiellement déshydratés, que nous avons adapté à des liposomes contenant des protéines dans notre laboratoire.

Nous présentons ici l'arrière-plan, de l'équipement, les techniques et les pièges de électroformation de liposomes géants de petites dispersions de liposomes. Nous commençons avec le protocole classique, qui doivent être maîtrisées avant de tenter les protocoles les plus difficiles qui suivent. Nous démontrons le processus de déshydratation partielle contrôlée de petits liposomes en utilisant équilibre vapeur avec des solutions salines saturées. Enfin, nous démontrons le processus de électroformation lui-même. Nous allons décrire l'équipement simple et peu coûteuse qui peut être fait en interne pour produire des liposomes de haute qualité, et de décrire l'inspection visuelle de la préparation à chaque étape afin d'assurer les meilleurs résultats.

Introduction

Liposomes géants (souvent appelés vésicules unilamellaires géantes, ou GUVS) ont principalement été utilisées pour étudier la physique et la chimie physique de bicouches lipidiques, y compris les études de déformation bicouche, la coexistence de phase latérale ("rafts"), la fusion de la membrane, etc ^1-4. Elles ont une structure cellulaire grossière comme: coque sphérique de la membrane entourant un intérieur aqueux qui peut facilement être fait différent de celui du tampon aqueux environnant. Ils sont, par définition, ≈ 1-100 m de diamètre, de sorte qu'ils peuvent être visualisés en utilisant une variété de méthodes de microscopie optique. Ils peuvent être fabriqués en utilisant des gradients osmotiques tendue ou la tension appliquée mécaniquement, de sorte que même si généralement doux, leurs propriétés peuvent être manipulées pour une manipulation aisée. En particulier, le contrôle de la "rigidité" du liposome, il est facile de former des plaques "liposome-inscrits" ou excisés pour l'électrophysiologie. Dans le passé, la reconstitution des canaux ioniques a été en grande partie réalisée en plan lipidique bilayers. Maintenant, la capacité à former des plaques de liposomes géants et utiliser le carquois considérable d'outils développés pour l'électrophysiologie classique (microscopie à fluorescence, micropipette aspiration, perfusion rapide et un contrôle de la température, etc) rend liposomes géants de plus en plus attrayant pour les études de reconstitution ^5,6.

Liposomes géants ont été faites par de nombreuses stratégies. En effet, les liposomes géants forment spontanément par un processus de gonflement lors d'un film lipidique séché est réhydraté ^4,7,8. Le désir de préparer plus rapidement plus, les liposomes plus uniformes conduit les chercheurs à d'autres approches, au premier rang desquels électroformation ^1,9. Électroformation s'appuie également sur l'hydratation d'un film lipidique séché, mais accélère le processus par l'application d'un champ électrique oscillant à travers le film lipidique. Le champ est appliqué au moyen de deux électrodes, soit des fils de platine ou de l'indium-étain (ITO) des lames de verre recouvertes, séparés par de l'eau outampon et sur laquelle les lipides sont déposées. En accélérant le gonflement des liposomes, on obtient un rendement plus élevé des grands liposomes. Ainsi, électroformation est devenue la méthode par défaut pour produire des liposomes géants ^4.

Le mécanisme de électroformation n'est pas entièrement comprise, et la plupart des protocoles sont développés de manière empirique (par exemple ^10,11). Néanmoins, nous pouvons en apprendre un peu plus sur ce à quoi s'attendre en tenant compte de la théorie et des résultats empiriques. Il est largement admis que électroformation se produit en conduisant flux électro-osmotique de tampon entre les bicouches lipidiques individuels empilés dans le film lipidique déposé ^10,11. Couplage électrostatique aux fluctuations thermiques des bicouches lipidiques est probablement aussi impliquée ^12. Ces hypothèses prédisent qualitativement limites supérieures de la fréquence du champ électrique et de la force qui peut être utilisé ^10,12. En particulier, il est prévu que les solutions à haute conductivité ( <eM> ie solutions salines physiologiques) réduisent les forces électrohydrodynamiques qui peut engager la électroformation liposome ^12. Taux d'écoulement électro-osmotique diminuent généralement avec l'augmentation de la concentration en sel et sont fréquemment atteint un sommet à une certaine fréquence d'oscillation du champ électrique (par exemple, bien que dans une géométrie différente, Green et al. ^13). Ainsi, les intensités de champ supérieures et des fréquences plus élevées sont raisonnables pour des solutions à haute conductivité, dans les limites de ^10.

Toutefois, les protéines membranaires sont susceptibles d'être incompatible avec la méthode habituelle de dépôt de lipides sur des électrodes pour la procédure electroswelling, notamment dans les solvants organiques qui sont ensuite évaporés pour laisser un film lipidique mince. Il ya deux voies principales de contourner cette difficulté: pour incorporer des protéines après la formation du liposome géant, ou d'adapter la manière dont les lipides sont déposés. Notre approche s'appuie sur d'autres ^5,11 à déposer les lipides et reconstitutiontuait une protéine de la membrane ainsi que d'une suspension de petites ou grandes "protéoliposomes". Nous décrivons le processus long et plus difficile de produire des protéoliposomes de protéines et de lipides purifiés ailleurs (Collins et Gordon, en révision). Nous décrivons ici le protocole en l'absence de toute protéine, mais il est le même lorsque la protéine est constituée, nous incluons les résultats montrant que protéoliposomes contenant le canal TRPV1 ion peuvent être transformés en GUVs et utilisés pour patch-clamp électrophysiologie. Dans toute approche électroformation, une inspection visuelle de l'échantillon de lipides au cours du processus de dépôt lipidique est essentielle au succès.

Notre approche peut être pertinent au-delà de l'application spécialisée pour la reconstitution du canal ionique. Dans le même temps depuis que nous avons mis au point ce protocole, et maintenant, il a également été montré comment la façon dont les lipides sont déposés sur des électrodes pour électroformation affecte l'hétérogénéité compositionnelle des GUVs en résultent. Bayk¹⁴ Al-Caglar et al. ont montré que GUVs liposomes formés à partir soigneusement déshydratés ont un 2,5 fois plus faible variation de la température de transition de miscibilité de GUVs formés à partir de mélanges de divers phospholipides et de cholestérol. Leurs travaux indiquent que les lipides, et en particulier le cholestérol, peut précipiter à partir du mélange de lipides déposés lors de solvants organiques, ce qui entraîne une grande variation spatiale dans la composition du film lipidique déposé. Ceci est particulièrement important pour les études sur le comportement de phase de membrane lipidique, mais peut aussi être critique aux expériences quantitatives sur le fonctionnement des canaux ioniques. Baykal-Caglar et al 's. Protocole est similaire, mais pas identique à la nôtre, et les lecteurs sont encouragés à étudier aussi.

Ce protocole (voir l'aperçu, figure 1) est l'un des nombreux qui pourrait être utilisé. Dans succès de électroformation de principe dépend du mélange de lipides, de l'hydratation, de la température, d'autres solutés (en particulier des ions), et deBien entendu la tension et la fréquence utilisée dans la formation. Comme électroformation devient mieux comprise, nous nous attendons à affiner notre protocole plus.

Enfin, il ya souvent une courbe d'apprentissage abrupte dans galvanoplastie liposomes géants. Nous suggérons la maîtrise du protocole classique (articles 1 et 4, et, si nécessaire, la section 5) avant d'apprendre à déposer lipides à partir de suspensions de liposomes (articles 2-5).

Protocol

1. Dépôt de lipides parmi les solvants organiques: protocole classique Éliminer les lipides de stockage à -20 ° C ou -80 ° C, réchauffer à température ambiante. Attention: les lipides sont très hygroscopiques, et beaucoup sont sensibles à l'oxygène. Couvrir lipides dans l'argon sec ou gaz azote et à toutes les étapes de minimiser l'exposition à l'air. Si nécessaire, suspendre les lipides dans le chloroforme ou le cyclohexane à mg / ml 1-10; …

Representative Results

Dans nos exemples, nous préparons des liposomes à partir d'un mélange d'environ 55% mol POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphocholine), 15% mol POPS (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphoserine , 30% mol de cholestérol, et de 0,1% en moles Texas Red-étiqueté 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoéthanolamine (TxR-DPPE). Cette composition a été choisi comme environ représentant des dorsales lipides ganglions de la racine 18. Nous constatons que 15% molaires chargé…

Discussion

Électroformation de liposomes géants s'est développé en une technique souple compatible avec divers lipides, des préparations et des tampons. Un contrôle minutieux du processus de dépôt de lipides est plus critique pour le succès. Nous avons présenté des outils simples pour rendre dépôt contrôlé de lipides provenant de petites préparations de liposomes un processus simple. L'humidité relative est essentielle à la bonne déshydratation des liposomes initiaux, et la valeur optimale varie avec la …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667