Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Summary

Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.

Abstract

Die Rekonstitution von Ionenkanälen in chemisch definierten Lipidmembranen für elektrophysiologische Aufzeichnung wurde eine leistungsfähige Technik zu identifizieren und erkunden Sie die Funktion dieser wichtigen Proteinen. Jedoch begrenzen klassischen Zubereitungen, wie planare Doppelschichten, die Manipulationen und Experimente, die auf dem rekonstituierten Kanal und seine Membran Umgebung ausgeführt werden können. Je mehr Zellen Struktur von Riesenliposomen ermöglicht traditionelle Patch-Clamp-Experimente ohne Steuerung des Lipidumgebung.

Elektroformation ist ein effizientes Mittel zur Erzeugung Riesenliposomen> 10 um im Durchmesser, die auf der Anwendung von Wechselspannung in eine dünne, geordnete Lipid Film, der auf einer Elektrodenoberfläche beruht. Da jedoch die klassische Protokoll fordert der Lipide aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht werden, ist es nicht mit weniger robust Membranproteine ​​wie Ionenkanäle und modifiziert werden muss. Kürzlich protocols wurden entwickelt, um Riesenliposomen von partiell dehydratisierten kleinen Liposomen, die wir Protein-haltigen Liposomen in unserem Labor angepasst haben Elektroform.

Wir stellen Ihnen hier den Hintergrund, Ausrüstung, Techniken und Fallstricke Elektroformation riesiger Liposomen aus kleinen Liposomendispersionen. Wir beginnen mit dem klassischen Protokoll, das erste sollte, bevor die größere Herausforderung Protokolle, die gemeistert werden folgen. Wir zeigen den Prozess der kontrollierten teilweisen Wasserentzug aus kleinen Liposomen mit Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen. Schließlich zeigen wir den Prozess der Elektroformation sich. Wir beschreiben einfache, kostengünstige Geräte, die in-house gemacht werden können, um qualitativ hochwertige Liposomen zu produzieren, und beschreiben Sichtprüfung der Vorbereitung auf jeder Stufe, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

Introduction

Riesen-Liposomen (oft als Riese einschichtigen Vesikeln oder GUVs) wurden in erster Linie verwendet, um die Physik und der physikalischen Chemie von Lipid-Doppelschichten, einschließlich Studien der Doppelschicht Verformung, seitliche Phase Koexistenz ("Rafts"), Membran-Fusion, etc ^1-4 studieren. Sie haben einen grob Zell-Struktur: Kugelschale Membran umgibt einen wässrigen Innenraum, die leicht gemacht werden, anders als die umgebenden wässrigen Puffer werden. Sie sind per definitionem ≈ 1-100 &mgr; m im Durchmesser, so dass sie abgebildet mit einer Vielzahl von Lichtmikroskopie Ansätze werden. Sie können gestrafft durch osmotischen Gradienten oder mechanisch angelegte Spannung ist, so daß, während in der Regel weich, deren Eigenschaften für die einfache Handhabung kann manipuliert werden. Insbesondere die Steuerung der "Steifigkeit" der Liposomen macht es einfach, "Liposomen-attached" oder ausgeschnitten Patches für die Elektrophysiologie zu bilden. In der Vergangenheit wurde Ionenkanal Rekonstitution weitgehend planaren Lipid b durchgeführtilayers. Jetzt macht die Fähigkeit, Patches von riesigen Liposomen zu bilden und nutzen die erheblichen Köcher von Werkzeugen für herkömmliche Elektrophysiologie entwickelt (Fluoreszenzmikroskopie Mikropipette Aspiration, schnelle Perfusion und Temperaturregelung, etc.) Riesenliposomen immer attraktiver für die Rekonstitution Studien ^5,6.

Riesen-Liposomen wurden von vielen Strategien vorgenommen. In der Tat bilden Riesenliposomen spontan durch eine Schwellung Prozess, wenn eine getrocknete Lipid-Film ^4,7,8 rehydriert wird. Der Wunsch, schneller vorzubereiten größeren führte gleichmäßigere Liposomen Forscher zu anderen Ansätzen, Leiter unter ihnen Elektroformation ^1,9. Elektroformation stützt sich auch bei der Hydratisierung eines getrockneten Lipidfilm, sondern beschleunigt das Verfahren durch die Anwendung eines oszillierenden elektrischen Feldes an die Lipid-Film. Das Feld wird durch zwei Elektroden, entweder Platindrähte oder Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasträger aufgebracht, getrennt durch Wasser oderPuffer und auf die die Lipide werden abgeschieden. Durch die Beschleunigung der Schwellung von Liposomen erreicht man eine höhere Ausbeute an größeren Liposomen. So hat Elektroformation werden die Standardmethode zur Erzeugung Riesenliposomen ^4.

Der Mechanismus der Elektroformation ist nicht vollständig geklärt, und die meisten Protokolle werden empirisch (zB ^10,11) entwickelt. Dennoch können wir lernen, ein wenig über das, was unter Berücksichtigung der Theorie und einige empirische Ergebnisse zu erwarten. Es wird allgemein angenommen, dass Elektroformation indem elektro-osmotischen Fluss des Puffers zwischen einzelnen Lipid-Doppelschichten in der abgeschiedenen Lipidfilm ^10,11 gestapelt auftritt. Elektrostatische Kupplung Wärmewechselbeständigkeit der Lipid-Doppelschichten ist wahrscheinlich auch beteiligt ^12. Diese Hypothesen qualitativ vorherzusagen Obergrenzen für das elektrische Feld der Häufigkeit und Stärke, die ^10,12 verwendet werden kann. Insbesondere ist es, dass eine hohe Leitfähigkeit Lösungen vorhergesagt ( <em> dh physiologischen Salzlösungen) reduzieren die elektrohydrodynamische Kräfte, initiieren das Liposom Elektroformation ^12. Mai. Elektroosmotischer Strömungsgeschwindigkeiten in der Regel mit steigender Salzkonzentration zu verringern und werden häufig zu einem bestimmten elektrischen Feldes Schwingungsfrequenz (zB wenn auch in einer anderen Geometrie, Green et al. ¹³⁾ ihren Höhepunkt. Somit sind höhere Feldstärken und höhere Frequenzen für hohe Leitfähigkeit Lösungen vernünftig, innerhalb der Grenzen ^10.

Allerdings sind Membranproteine ​​wahrscheinlich mit dem üblichen Verfahren zum Abscheiden Lipide auf Elektroden für die Electroswelling Verfahren, nämlich in organischen Lösungsmitteln, die anschließend an einen dünnen Lipidfilm zu hinterlassen eingedampft unvereinbar. Es gibt zwei grundsätzliche Wege um diese Schwierigkeit: an Proteine ​​nach giant Liposombildung enthalten oder anzupassen, wie die Lipide abgeschieden werden. Unser Ansatz baut auf andere ^5,11 die Lipide und Rekonstitution hinterlegentuierten Membranprotein zusammen aus einer Suspension von kleinen oder großen "Proteoliposomen". Wir beschreiben die langwierige und schwieriger Prozess der Herstellung von Proteoliposomen gereinigtes Protein und Lipiden an anderer Stelle (Collins und Gordon, in review). Hier beschreiben wir das Protokoll in Ermangelung einer Protein, aber es ist das gleiche, wenn Protein eingebaut wird, wir zählen die Ergebnisse zeigen, dass Proteoliposomen mit dem Ionenkanal TRPV1 in GUVs umgewandelt werden kann und für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie. In jedem Elektroformation Ansatz, ist die visuelle Inspektion der Lipid-Probe während der Lipidablagerung Prozess entscheidend für den Erfolg.

Unser Ansatz relevant sein können über die spezielle Anwendung zu Ionenkanal Rekonstitution. In der Zeit, da wir zuerst dieses Protokoll entwickelt und jetzt, es hat sich auch gezeigt, wie die Art und Weise, in der Lipide auf Elektroden für Elektroformation abgelagert werden die kompositorische Heterogenität der resultierenden GUVs betrifft. Baykal-Caglar et al. zeigten, dass ¹⁴ GUVs aus sorgfältig entwässert gebildeten Liposomen eine 2,5 mal kleiner Variation hatte in der Mischungslücke Sprungtemperatur von GUVs aus Mischungen verschiedener Phospholipide und Cholesterin gebildet. Die Arbeit zeigt, dass Lipide und insbesondere Cholesterin, ausfallen kann aus dem Lipidgemisch wenn aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht, was zu großen räumlichen Abweichung in der Zusammensetzung der abgeschiedenen Lipidfilm. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung der Lipid-Membran Phasenverhalten, kann aber auch kritisch für quantitative Experimente Ionenkanalfunktion. Baykal-Caglar et al. 'S Protokoll ist ähnlich, aber nicht identisch mit unserer eigenen, und die Leser werden ermutigt, es so gut zu studieren.

Dieses Protokoll (siehe Übersicht, Abbildung 1) ist eine von vielen, die genutzt werden könnten. Im Prinzip Elektroformation Erfolg hängt von der Lipid-Mischung, Flüssigkeitszufuhr, Temperatur, andere gelöste Stoffe (vor allem Ionen), und derNatürlich ist die Spannung und Frequenz in Bildung eingesetzt. Wie Elektroformation wird besser verstanden, erwarten wir unser Protokoll mehr zu suchen.

Schließlich gibt es oft eine steile Lernkurve in Galvanotechnik Riese Liposomen. Wir schlagen vor, die Beherrschung der herkömmlichen Protokoll (§ § 1 und 4, und, falls erforderlich, Abschnitt 5) vor dem Lernen zu Lipiden aus liposomalen Suspensionen (§ § 2-5) zu hinterlegen.

Protocol

1. Ablagerung von Lipiden aus organischen Lösungsmitteln: Klassische Protocol Entfernen von Lipiden aus der Lagerung bei -20 ° C oder -80 ° C, auf RT erwärmt. Achtung: Lipide sind extrem hygroskopisch, und viele sind empfindlich gegenüber Sauerstoff. Titelbild Lipide in trockenem Argon oder Stickstoff und in allen Schritten Minimierung der Exposition gegenüber Luft. Wenn erforderlich, zur Aussetzung der Lipide in Chloroform oder Cyclohexan bei 1-10 mg / ml; beachten S…

Representative Results

In unseren Beispielen bereiten wir Liposomen aus einem Gemisch von etwa 55 Mol-% POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin), 15 mol% erscheint (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-Phosphoserin , 30 mol% Cholesterin und 0,1 mol% Texas Red-markierten 1,2-dipalmitoyl-sn-Phosphoethanolamin (TxR-DPPE). Diese Zusammensetzung wie etwa Vertreter der Spinalganglien Lipide 18 gewählt wurde. Wir bemerken, dass 15 mol% geladen Lipid (hier POPS) ist in der Nähe der Grenze dessen, was in …

Discussion

Elektroformation riesiger Liposomen wurde in eine flexible Technik kompatibel mit verschiedenen Lipiden, Zubereitungen und Puffer entwickelt. Eine sorgfältige Steuerung der Lipidablagerung-Verfahren ist sehr entscheidend für den Erfolg. Wir haben einfache Werkzeuge vorgestellt, um eine kontrollierte Abscheidung von Lipiden aus kleinen Liposomenzubereitungen ein einfacher Prozess zu machen. Die relative Feuchtigkeit ist für die einwandfreie Entwässerung der ersten Liposomen, und der optimale Wert wird mit der anfäng…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667