Method Article

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

DOI:

10.3791/50231

⸱

January 6th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Diabetology, Paul Langerhans Institute Dresden, 2Department of GI-, Thoracic- and Vascular Surgery, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 3Department of Endocrinology and Metabolism, Metabolic Unit University of Pisa, 4Labs DC0522, Lilly Corporate Center, 5Genomics, Faculty of Medicine Imperial College London, 6Vital-IT, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 7Clinical Biochemistry, Hannover Medical School, 8Cell Physiology and Metabolism, Medical School, University of Geneva, 9Department of Pathology, University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden, 10R&D DIAB Division / Translational Medicine, Sanofi-Aventis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

레이저 microdissection (LMD)는 실질 1,2의 미세한에서 선택한 셀과 조직의 복구를 할 수있는 기술입니다. 해부 세포는 이러한 transcriptomic 또는 proteomic 연구, DNA 평가 나 염색체 분석 2,3 등 조사의 다양한 사용할 수 있습니다. LMD의 특히 어려운 응용 프로그램은 RNA (4)의 lability로 인해 셀이 같은 췌장 등의 RNases의 풍부 조직 분석하던 때 특히 눈에 띄는 될 수 transcriptome 분석이다. 대상 세포의 빠른 식별 및 수집을 가능하게 microdissection 프로토콜은 조직 처리 시간을 단축 할 수 있으며, 결과적으로, RNA의 보존을 보장하기 위해이 설정에 필수적입니다.

여기 transcriptomic 연구 5에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 베타 세포를 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 0.5-1에 대한 C의 췌장의 작은 조각m 3 sectioning 때까지 즉시 2 Methylbutane 차가운에 냉동 조직 - 테크 10월 컴파운드에 포함 resected의 췌장의 표본의 건강 나타나는 여백,에서 절단하고, -80에 저장 ° C 있었다. 10 μm 두께의 40 시리얼 섹션은 1-2 분의 그라 이오 스탯 내부 건조하고, -80에 저장 유리 슬라이드, ° C.에 개별적으로 전송, -20 ° C 설정에 따라 그라 이오 스탯을 삭감했다

즉시 레이저 microdissection 절차 전에 섹션은 얼음 차가운 백퍼센트에서 두 1 분 incubations하여 얼음처럼 차가워에서 수정 갓 30 초에 70 %의 에탄올을 준비, 얼음 차가운 DEPC - 처리 물에 5-6 딥으로 세척하고, 건조 된 에탄올은 4 분 동안 크실렌 (조직 탈수에 사용되는)에 의해 다음, 조직 섹션 3-5 분 동안 나중에 한 후 공기 건조했다. 중요한 것은, 모든 단계는 크실렌의 부화를 제외하고 얼음처럼 차가운 시약을 사용하여 수행되었습니다 - 이전에 설명 된 프로토콜을 6 이상 수정. UT얼음 차가운 시약의 ilization는 베타 세포의 고유 autofluorescence의 발음 증가로 이어진, 그들의 인정을 촉진. microdissection를 들어, 4 개의 섹션은 각 시간 건조했다 : 두 수분과 표백에서 조직을 보호하기 위해 호일로 싼 50 ML 튜브에 배치 된, 나머지 두 사람은 즉시 microdissected되었습니다. 이 절차는 (AutoLPC) 모드를 Catapulting 자동 레이저 압력을 채용 PALM MicroBeam 악기 (Zeiss)를 사용하여 수행되었습니다. 40-60 분보다 더 이상 필요 넷 cryosections에서 베타 세포 / 작은 섬의 해부의 완성. 셀은 한 AdhesiveCap으로 수집, 10 μl 용해 버퍼로 lysed되었습니다. transcriptomic 분석을 위해 각 단일 RNA 시료는 10 셀 microdissected 샘플, 피코 순수 RNA 절연 키트 (악튜러스)를 사용하여 RNA 추출 다음을 조합하여 얻은 것입니다. 이 프로토콜은 따라서 자신의 신속하고 정확한 인식과 C을 촉진, 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상ollection. 이 절차의 추가 개선 2 형 당뇨병과 관련된 변경 사항을보다 잘 이해 가능한 의미와 함께, phenotypically 다른 베타 세포의 절개를 사용하도록 설정할 수도 있습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 인간 췌장 조직의 동결

  1. 지방 조직, 혈관, 신경 및 메스와 핀셋과 비 parenchymal 조직을 제거하고 조각 (~ 0.5-1 cm 조각)로 췌장 조직을 잘라.
  2. Cryomold의 중심에 하나 췌장 조직 조각을 놓고, 차가운 조직 - 테크 10월 컴파운드로 완전히 커버. 그의 아래 액체 질소에 미리 냉각 2 Methylbutane와 스냅 - 동결로 덮여 있습니다 병에 Cryomold을 놔. -80 ° C.에있는 냉동 샘플을 저장

2. 냉동 섹션의 작성

  1. RNA의 변성을 피하기 위해 모든 단계에 걸쳐 장갑을 착용한다.
  2. 멀리 차가운 100 % 에탄올과 RNase와 그라 이오 스탯 나이프, 표본 홀더와 붓를 청소합니다. 그라 이오 스탯 내부의 냉동 조직을 배치합니다.
  3. 조직, 칼과 붓 -20 ° C.에 도달 할 때까지 기다리 기다리는 동안 그라 이오 스탯 챔버 내부 SuperFrost 플러스 슬라이드와 사전 시원한 그들을 레이블을조직 -20 ° C.에 도달 할 수에 대한
  4. 표본 홀더에있는 조직 - 테크 10월 컴파운드를 적용하고 상단에 고정 된 조직을 배치합니다.
  5. 조직 - 테크 10월 컴파운드이 고정되면 c....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1에 도시 된 바와 같이, 수정 건조 프로토콜은 이전의 게시 된 프로토콜 6에 비해 베타 세포의 autofluorescence의 개선을 이끌었다. 설명 프로토콜 적용, 39 수술 췌장 표본의 각 31'544'704 μm 세 조직 / 췌장 표본의 평균 (: - 81'522'153 μm 3 8'742'390 범위) 40 시리얼 cryosections를 생성하는 데 사용 된 표 1에 표시된. 이 150 μm의 직경, 또는 35,000 β-세포의 약 18 췌장 섬의 볼륨을 나타냅니다. 38 다른 섬 / 췌장 표본의 평균 (범위 : 19-80 섬)에서 유래 조직은 각각의는 일반적으로 두 개 이상의 연속 섹션에서 관찰되었다. 다른 표본 간의 섬의 수율에 큰 변화는 감지의 조직 소스, 췌장 머리 나 꼬리하거나,뿐만 아니라 운영자의 진보적 인 개선의 이질성을 반영각 섹션의 검사에 투신 한 10 분 시간 내에 섬의 이온.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 수술 췌장 표본의 인간 섬의 레이저 microdissection (LMD)에 대한 신뢰할 수있는 접근 방법을 설명합니다. LMD 현미경을 사용할 수 있다고합니다,이 절차는이를 모두 비 당뇨병과 2 형 당뇨병 환자 과목에서 인간의 작은 섬 소재에 대한 액세스를 증가, 부분 pancreatectomies를 수행하는 연구 기관에서 구현 될 수 있습니다. 이 작은 섬 고립에 제공 pancreata의 소수 주어진 특히 해당됩니다. 의 Favourable 관점이 collagenase의 소화에 의해 작은 섬 고립에 비해 LMD하면 조직의 explantation 및 RNA 추출 7 베타 세포의 농축 7뿐만 아니라 거칠고 기계 및 효소 조작 (8)의 소지를 없애기 위해 섬의 처리 사이의 감소 시간이며, 유전자 발현 프로필을 변경 할 수 9,10. 부분적으로 pancreatectomized 환자의 경우 더 많은 임상 및 신진 대사 정보 기관.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는이 프로젝트의 여러 단계에 도움, 조언과 중요한 입력을 제공하는 모든 동료에게 감사하고 싶습니다. 이 비디오 문서의 생산은 IMIDIA (의 자금이 지원 된 http://www.imidia.org ), 교육 및 당뇨병 연구 독일 센터 (DZD로 연구 (BMBF)에 대한 독일의 성 http://www.dzd - ev.de ) 기술 드레스덴 (Dresden)의 대학에서 대학 병원 칼 구스타프 이카루스 호. 이 책자에 이르는 작품 부여 계약을 N ° 155005 (IMIDIA), 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA에서 금전적 인 기부로 구성되어있는 자원을 아래에 혁신적인 의약품 사업 공동 인수의 지원을 받고 있습니다 회사의 종류 기여 인치

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
2 Methylbutane (이소 펜탄) 로스 3927.1
AdhesiveCap (불투명, 500 μl) ZEISS 415190-9201-000
Cellstar 튜브 (50 ML) greiner 바이오 - 원 210 261 지원 스커트로
Cellstar 튜브 (50 ML) greiner 바이오 - 원 227.261
디 에틸 pyrocarbonate (DEPC) 시그마 D 5758
드라이 아이스
절대 에탄올 VWR 20821.310
액체 질소
브러쉬를 페인트
PALM MicroBeam ZEISS
필 - 편도 삽입 금형 (립니다), 12 X 12mm ProSciTech RR12 탑 내부 22x22 mm, 깊이 21mm
악튜러스 PicoPure 냉동 RNA 분리 키트 응용 Biosystems KIT 0,204
플라스틱 클램프
면도칼
RNase 무료 DNase 세트 Qiagen 79,254
RNaseZAP 시그마 R 2020
메스 /외과 블레이드 테크노는 잘라 내기 2800111
SuperFrost 플러스 부착 현미경 슬라이드 열 과학 J1800AMN​​Z 25x75x1.0 mm
조직 - 테크 10월 컴파운드 사쿠라 4583 또는 0807000022
족집게 브라운 BD168R
크실렌 VWR 28975.291

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionPancreatic IsletsHuman TissueTissue PreparationCryosectioningAutofluorescence DetectionRNA PreservationTranscriptomic AnalysisPALM MicroBeamAdhesiveCap Collection

Related Articles