عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم^{2 +} العابرون والتيارات غشاء

Summary

وصفنا عزلة myocytes الأذيني الإنسان والتي يمكن استخدامها لكا داخل الخلايا^{2 +} القياسات في تركيبة مع دراسات التصحيح، المشبك الكهربية.

Abstract

دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف القلب الخلوية كا ^{2 +} التعامل مع التشوهات العضلية يتطلب معزولة. وبالإضافة إلى ذلك، إمكانية للتحقيق myocytes من المرضى الذين يستخدمون هذه التقنيات هو شرط لا تقدر بثمن لتوضيح الأساس الجزيئي لأمراض القلب مثل الرجفان الأذيني (AF). ¹ هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان والتي هي مناسبة لكلا دراسات التصحيح، المشبك والقياسات في وقت واحد من تركيزات ⁺ داخل الخلايا كا ^2. أولا، يتم المفروم الزوائد الأذيني الحق تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح إلى قطع الأنسجة الصغيرة ("أسلوب قطعة") وغسلها في كا ^{2 +} خالية حل. ثم يتم هضمها وقطع الأنسجة في كولاجيناز والبروتيني تحتوي على حلول مع 20 ميكرومتر كا ^{2 +.} بعد ذلك، myocytes معزولة هي harveSTED عن طريق الترشيح والطرد المركزي لتعليق الأنسجة. وأخيرا، يتم ضبط كا ^{2 +} التركيز في حل تخزين الخلايا متدرج إلى 0.2 ملم. نناقش بإيجاز معنى كا ^{2 +} والكالسيوم ^{2 +} التخزين المؤقت أثناء عملية العزل، وكذلك تقديم التسجيلات ممثل امكانات العمل والتيارات غشاء، على حد سواء في وقت واحد جنبا إلى جنب مع كا ^{2 +} قياسات عابرة، التي أجريت في هذه myocytes معزولة.

Introduction

دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف الخلوية كا ^{2 +} تشوهات تتطلب معالجة العضلية معزولة. عادة ما يتم الحصول على هذه عقب التعرض في المختبر عينات من أنسجة القلب إلى الإنزيمات الهضمية (كولاجيناز، هيالورونيداز، ببتيداز الخ). منذ التقرير الأول للعزلة myocytes القلب قابلة للحياة في عام 1955 ⁽²⁾ وقد وضعت كمية كبيرة من البروتوكولات من أجل حصاد العضلية الأذيني البطيني واحد من الأنواع المختلفة بما في ذلك الماوس، الجرذان والأرانب والكلاب والخنازير الغينية والبشرية. في هذا الاستعراض ونحن نركز على عزلة myocytes الأذيني الإنسان. فيما يتعلق بإجراءات لعزل myocytes من الأنواع الأخرى التي تشير إلى "ورثينجتون الأنسجة التفكك دليل" التي تقدمها ورثينجتون بيوكيميائية كورب، الولايات المتحدة الأمريكية ( www.tissuedissociation.com ).

<p class= "jove_content"> وتستمد الأذيني بروتوكولات العزلة خلية عضلية الإنسان عموما من الطريقة الموصوفة من قبل بوستامانتي، وآخرون. ³ هنا نقدم وصفا خطوة بخطوة من تقنية، والتي يتم تكييفها من أسلوب المنشورة سابقا، من أجل الحصول myocytes الأذيني مناسبة ليس فقط للتجارب التصحيح، المشبك ولكن أيضا لفي وقت واحد داخل الخلايا كا ^{2 +} القياسات. ^4-11

Protocol

تحتاج البروتوكولات التجريبية لتتم الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية وجميع المرضى الذين يحتاجون لإعطاء الموافقة المسبقة عن مكتوب. وقد وافق بحثنا من قبل لجنة أخلاقيات الطبية كلية مانهايم، جامعة هايدلبرغ (# 2011-216N-MA) وأجريت في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية من أجل رفاهية الإنسان. أعطى جميع المرضى الموافقة المسبقة عن مكتوب. 0. الحصول على الأنسجة الأذيني الإنسان خلال الإجراءات الروتينية القسطرة لدى المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح لتجاوز القلب التطعيم، وعادة ما يتم إزالة غيض من احقة الأذين الأيمن، ويمكن استخدامها لعزل العضلية الأذيني. بعد الختان يتم نقل عينات الأنسجة على الفور في أنبوب 50 مل الصقر العقيمة مع كا 2 + خالية حل النقل التي تحتوي على 2،3-butanedione monoxime (الجدول الأول؛ BDM، المانع مقلص، ومنع خلية عضلية جontracture). مع أوقات النقل بين 30 و 45 دقيقة، لم نكن ندرك ميزة واضحة من التبريد أو الأوكسجين فيما يتعلق بكل من عدد ونوعية العضلية الأذيني المعزول. في وسائل النقل العامة إلى المختبر يجب أن تكون سريعة قدر الإمكان. ومع ذلك، إذا لا يمكن تجنبها وقتا أطول والنقل، والنقل في 4 درجات مئوية في حل الاوكسيجين قد يكون من المفيد. 1. Prearrangements التبديل على thermocirculator، التي تسيطر على درجة حرارة الدورق تغلف (الجدول الثاني). تأكد من أن درجة الحرارة داخل الدورق يساوي 37 درجة مئوية. تغطية الكأس مع غطاء زجاجي للحفاظ على درجة حرارة ثابتة داخل الدورق في جميع مراحل عملية عزل كامل. تزن كولاجيناز الأول والرابع والعشرون البروتياز إلى ثلاثة أكواب الزجاج وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. سوف تضعف الانزيمات فقط قبل الاستخدام. مخزن 20 مل من كا 2 + حل الحرة في طبق بتري في 4 درجات مئوية. تخزين 250 مل من كا 2 + حل الحرة في حمام الماء عند 37 درجة مئوية. 2. تنظيف الأنسجة نقل عينات الأنسجة مع الحل النقل في طبق بتري (~ 10 سم القطر) وإزالة الأنسجة الدهنية تقريبا باستخدام مقص. وزن عينة الأنسجة. وتستخدم ما بين 200 و 600 ملغ لعزل الخلية. يمكن تجميد الأنسجة المتبقية في النيتروجين السائل لتحليل الكيمياء الحيوية في وقت لاحق. نقل عينات الأنسجة في طبق بتري تحتوي على 20 مل كا 2 + حل مجانية في 4 ° C (انظر الخطوة 1.3) وختم عينة الأنسجة إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم 3 في الحجم. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية عند 37 درجة مئوية وتحت بالغاز المستمر مع 100٪ O 2. غيض ماصة يمكن وضعها على أنبوب الأكسجين لتجنب محتدما قوية وتوليد تدفق الهواء المستمر. نقل قطع الأنسجة جنبا إلى جنب مع كا 2 + خالية حل فيإلى الدورق تغلف ويحرك المزيج بعناية لمدة 3 دقائق مع التحريك المغناطيسي بار. وقف اثارة والسماح للقطع الأنسجة ليستقر لبضع ثوان. توتر بعناية طاف من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني). إعادة قطع الأنسجة ضبط النفس من شبكة إلى الدورق باستخدام ملقط. إعادة ملء كوب مع كا 2 + حل حرة وكرر الخطوة غسل 2.4 و 2.5 مرتين. 3. الهضم الأنزيمي الأول اعادة تعليق قطع الأنسجة مع 20 مل إنزيم حل E1 (الجدول الأول) التي تحتوي على كولاجيناز والبروتيني ويقلب بعناية لمدة 10 دقيقة. إضافة 40 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل للحصول على تركيز النهائي من 20 ميكرومتر كا 2 +. بعد 35 دقيقة سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) بطريقة أن معظم قطع الأنسجة البقاء في الدورق. عودة بقيةأمطرت قطع الأنسجة من شبكة إلى الدورق. 4. الهضم الأنزيمي الثاني Resuspend وقطع الأنسجة مرة أخرى مع 20 مل انزيم حل E2 تحتوي على كولاجيناز أنا فقط (الجدول الأول). إضافة 40 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل على الفور للحصول على تركيز النهائي من 20 ميكرومتر كا 2 +. أثناء استخدام مقص الهضم الثاني إلى مزيد من جلطات ختم الأنسجة في بعض الأحيان. بعد 5 دقائق أخذ عينة باستخدام ماصة باستور للتحقق من تفكك الخلايا. كرر هذا كل 2-3 دقائق حتى تظهر على شكل قضيب، العضلية المخططة. وقف اثارة والسماح للقطع الأنسجة ليستقر لمدة 20-30 ثانية. سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) إلى 50 مل أنبوب فالكون (أنبوب). إعادة قطع الأنسجة ضبط النفس من شبكة إلى الدورق. اعادة تعليق قطع الأنسجة في الدورق مع 20 مل ستوراحل شركة جنرال الكتريك (الجدول الأول) 10 وكذلك فصل الخلايا عن طريق سحن الميكانيكية لطيف باستخدام ماصة المصلية 20 مل مع موزع. في محاولة لتجنب تشكيل فقاعة فقاعات منذ تضر بقاء الخلية والجودة. سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) في أنبوب 50 مل الصقر (أنبوب B). 5. الإعداد النهائي والنهائي من التعديل كا 2 + تركيز أجهزة الطرد المركزي لكلا فالكون أنابيب ألف وباء (انظر الخطوة 4.5 و 4.7) في 95 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف من كل من الأنابيب بعناية من قبل الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه. تجاهل طاف. اعادة تعليق كل من الكريات في 1.5 مل من محلول التخزين (الجدول الأول) كل (درجة حرارة الغرفة). إضافة مرتين 7.5 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 حل كل فالكون ويقلب بعناية. احتضان لمدة 10 دقيقة بعد كل خطوة. إضافة 15 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل النهائي للحصول على الكالسيوم 2 + تركيز 0.2 ملم. 6. التحميل من Myocytes مع كا نيون 2 + مؤشر فلوو-3 AM (الشكل 1) نقل 1.5 مل من تعليق خلية (أنبوب A و / أو أنبوب B) في أنبوب microcentrifuge 2 مل (أنبوب إيبندورف). يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية في إطار النظر في الحساسية للضوء الفلورسنت من كا 2 + المؤشر فلوو-3. حل 50 ميكروغرام من نفاذية الغشاء acetoxymethyl مشتقة استر من فلوو-3 (فلوو-3 صباحا، والجدول الثالث) في 44 ميكرولتر من بلورونيك F-127 (الجدول الثالث) حل سهم (20٪ W / V في DMSO اللامائية) للحصول على قطرها 1 مم فلوو-03:00 حل الأوراق المالية، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع على الأكثر. إضافة 15 ميكرولتر من فلوو-03:00 محلول المخزون إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 1.5 مل من تعليق خلية (انظر الخطوة 6.1) وتستنهض الهممبعناية. احتضان تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في مربع مبهمة بصريا. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في حوالي 6،000 دورة في الدقيقة. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من محلول حمام (الجدول الرابع). ترك تعليق خلية لمدة 30 دقيقة لإزالة الأسترة قبل البدء بالتجارب. 7. في وقت واحد التصحيح، المشبك وEpifluorescent كا 2 + قياسات منذ قياسات التصحيح، المشبك ليست هي الموضوع الرئيسي لهذا الاستعراض، ونحن إحالة القارئ المهتم إلى المنشورات الأخرى التي تقدم أكثر في وصف عمق هذه التقنية. 11-14 من اجل اكتمال نحن نقدم ملخصا موجزا لبروتوكول لقياس إمكانات العمل أو L-نوع كا 2 + التيارات، على حد سواء في وقت واحد جنبا إلى جنب مع كا 2 تسجيلات +-عابرة. خلال التجارب التي superfused myocytes عند 37 درجة مئوية مع حمام solutiفي (الجدول الرابع) باستخدام نظام نضح السريع (Octaflow IITM، ALA الأدوات العلمية، NY). للتجارب الجهد المشبك، يتم حظر K + التيارات بإضافة 4 امينوبيرين (5 ملمول / لتر) وبووتون 2 (0.1 مليمول / لتر) إلى حل حمام. وتستخدم microelectrodes الزجاج البورسليكات وينبغي أن يكون التسديد على المقاومة من 2-5 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة (الجدول V). بالإضافة إلى فلوو-3:00 التحميل من myocytes (راجع الخطوة 6)، يتم تضمين فلوو-3 أيضا في حل ماصة (الجدول V). هو متحمس مضان في 488 نانومتر والضوء المنبعث (<520 نانومتر) تم تحويله إلى [كا 2 +] ط افتراض حيث k د = ثابت التفكك لفلوو-3 (864 نM)، F = فلوو-3 مضان؛ F الحد الأقصى = كا 2 + مضان المشبعة التي تم الحصول عليها في نهاية كل تجربة 12 وتسجل كل الإشارات الكهربائية والكالسيوم 2 + إشارات epifluorescent في وقت واحد. يتم تحفيز إمكانات العمل عند 0.5 هرتز في الوضع الحالي، المشبك باستخدام 1 ميللي ثانية البقول الحالية من قوة عتبة 1.2X. L-نوع كا 2 + يتم قياس التيارات في وضع الجهد المشبك باستخدام المحتمل عقد -80 بالسيارات و100 ميللي ثانية منحدر النبض إلى -40 بالسيارات لإبطال نشاط نا سريع + المتداولة، يليه 100 ميللي ثانية نبض اختبار ل+10 بالسيارات عند 0.5 هرتز.

Representative Results

ويبين الشكل 2A ثلاثة أمثلة ممثل من myocytes الأذيني حق من حقوق الإنسان معزولة. لقياس العائد الخلية نحن ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية (الخطوة 5.5) على شريحة المجهر CellFinder ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). غلة خلية بلغ متوسط ​​في الشكل 2B تشير بوضوح إلى أن هناك اتجاها لانخفاض العوائد في الخلية AF المزمن (الكاف) عينات المرضى (أنبوب A: 16.5 ± 3.1 cells/10 ميكرولتر (ن = 29) مقابل 5.1 ± 2.3 ميكرولتر cells/10 (ن = 10) في SR والكاف، على التوالي، P <0.05؛ أنبوب B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ميكرولتر (ن = 29) مقابل 5.9 ± 2.0 cells/10 ميكرولتر (ن = 9) في ريال وCAF، على التوالي، P = 0.107). وترد أمثلة ممثل قياسات العمل ذات الإمكانات والتسجيلات في وقت واحد من عصاري خلوي كا 2 + العابرين في الشكل 3. في حوالي 90٪ من الخلايا التحقيق، روقال انه عمل لإمكانيات أثار كا 2 + الإفراج يسبب تقلصات خلية واضحة ومنتظمة. كما ذكرت سابقا، فإن غشاء المحتملة يستريح، وهو مؤشر مقبول لسلامة الخلية، وبلغ متوسط ​​حوالي -73.9 ± 2.7 بالسيارات (ن = 23/10 myocytes / المرضى) و-77.7 ± 1.8 بالسيارات (ن = 19/8 myocytes / المرضى ) في SR والكاف على التوالي (P> 0.05) يظهر 15 الشكل 4 التسجيلات في وقت واحد ممثل الجهد بوابات L-نوع كا 2 + التيارات وعصاري خلوي كا 2 + العابرين. تطبيق غير انتقائية إيزوبرينالين ناهض β-المستقبلات (1 ميكرومتر) يزيد سعة من كلا أنا كا، L وعصاري خلوي كا 2 + العابرين، مما يوحي سليمة β الأدرينالية إشارة تتالي تنبيغ. Figure 1. مخطط تدفق من myocytes فلوو-3:00 تحميل البروتوكول (راجع الخطوة 6،1-6،5). M / V والكتلة / الحجم. الشكل 2. A، معزولة myocytes الأذيني حق من حقوق الإنسان بعد ساعة واحدة في حلول التخزين. B، يعني ± SEM من العائد خلية تحسب في 10 ميكرولتر من الخلايا في حل التخزين (انظر الخطوة 5.5). ن يشير إلى عدد من الأعمال التحضيرية داخل كل مجموعة. * P <0.05. الشكل (3). التسجيلات الممثل العمل لإمكانيات أثار كا 2 +-العابرين (CAT) في خلية عضلية الأذيني من إيقاع الجيوب الأنفية ومركز حقوق الإنساناونك مريض الرجفان الأذيني. الأعلى: المحقونة غشاء الحالية (I M) تستخدم لتحفيز (0.5 هرتز). أدناه: تسجيل في وقت واحد من غشاء المحتملة (V M)، واتفاقية مناهضة التعذيب أثار (القاع). (Replotted بإذن من فويت وآخرون. 2012) 15 الشكل 4. تسجيلات ممثل (1 ميكرومتر) تأثير إيزوبرينالين على L-نوع كا 2 + الحالية، أثار كا 2 +-العابرين (CAT) في خلية عضلية الأذيني من إيقاع الجيوب الأنفية ومريض الرجفان الأذيني المزمن. الأعلى: الجهد المشبك بروتوكول (0.5 هرتز). أدناه: تسجيل في وقت واحد من مجموع غشاء الصافية الحالية (I M)، والتي تعكس في الغالب L-نوع كا 2 + القط الحالي (وسط) واثار (القاع). (Replotted بإذن من فويت،وآخرون 2012) 15 الجدول I. حلول. الجدول الثاني. معدات معينة. الجدول الثالث. لتحميل المواد من myocytes مع فلوو-3 PM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="الجدول 4" fo:content-العرض = "2.5in" fo: "> الجدول الرابع. حل نوم للالتصحيح، المشبك. الجدول خامسا حل ماصة للالتصحيح، المشبك *.

Discussion

هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان من الزوائد الأذيني حق الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح. من اجل استخدام هذه myocytes لقياس عصاري خلوي كا ^{2 +} نحن تكييفها طريقة التي سبق وصفها ^4-11 بحذف EGTA من حلول التخزين.

بالفعل في عام 1970 لوحظ أنه على الرغم من myocytes فصل في وجود الكالسيوم ^{2 +} أثناء عملية الهضم، كل منهم في انكماش وغير قابلة للحياة. ^16،17 لذلك، يتم تنفيذ عزل خلية في كا ^{2 +} خالية حل. ومع ذلك، فإن إعادة إدخال تركيزات الفسيولوجية للكا ^{2 +} أسفرت السريع كا ^{2 +} تدفق وموت الخلايا. وقد وصفت ذلك بأنه كا ^{2 +} ظاهرة التناقض الذي لوحظ أصلا في قلوب perfused بواسطة زيمرمان وهولسمان ¹⁸ تعديلات من وسائل الإعلام بما في ذلك الحد من عزلة الرقم الهيدروجيني إلى 7.0، <سوب> 19 إضافة taurin ²⁰ أو كميات صغيرة من الكالسيوم ^{2 +} (راجع الخطوة 3.2 و 4.1)، ²¹ فضلا عن تخزين myocytes معزولة في EGTA تحتوي على تخزين حل ²² وقد اقترحت لمنع كا ^{2 +} المفارقة ¹⁷ ومع ذلك، فمن المعروف جيدا أن كا ^{2 +} التخزين المؤقت من خلال EGTA يقلل من السعة من نوع L-كا ^{2 +} الحالية التي يسببها كا ^{2 +} سعة عابرة والنتائج في الاضمحلال ثنائي الطور من كا ^{2 +} العابرين. ²³ ولذلك، فإننا حذفت EGTA في جميع مراحل عملية عزل كامل من أجل الحصول على كا ^{2 +} العابرين مع الخصائص النموذجية، ويضمحل حيد الطور. لحماية الخلايا من كا ^{2 +} المفارقة رفعنا النهائي كا ^{2 +} تركيز المحلول التخزين بطريقة تدريجية حتى 0.2 ملم.

اختيار كولاجيناز هو على الارجح الخطوة الأكثر أهمية لنجاح العزلة خلية عضلية. كول التقليديةagenases استعدادات الخام تم الحصول عليها من نسج كلوستريديوم وتحتوي على كولاجيناز بالإضافة إلى عدد من proteinases، polysaccharidases والليباز الأخرى. استنادا على collagenases تكوين عامة تنقسم إلى أنواع مختلفة. رثينجتون ²⁴ أنواع كولاجيناز الأول والثاني استخدمت بنجاح لعزل myocytes الأذيني الإنسان. ^{4-10،15،25-30} في بروتوكول موضح لدينا في الوقت الحاضر نحن نوصي باستخدام كولاجيناز النوع الأول، على الرغم من أننا كنا أيضا قادرة على الحصول على كميات مقبولة من خلايا قابلة للحياة باستخدام كولاجيناز من النوع الثاني. ومع ذلك، وحتى داخل نوع واحد كولاجيناز هناك تباين كبير دفعة إلى دفعة فيما يتعلق بأنشطة الانزيم. تتطلب هذه الاختلافات حذرا اختيار دفعة واختبار مختلف دفعات لتحسين إجراء العزل. وتتوفر أداة دفعة الاختيار على الانترنت من رثينجتون بيوكيميائية شركة ( http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) يمكن استخدامها للعثور على دفعات المتاحة مع التشكيل التي قد تظهر لتكون مناسبة للعزلة myocytes الأذيني الإنسان. حاليا نحن نستخدم كولاجيناز النوع الأول مع 250 U / ملغ كولاجيناز النشاط، 345 U / ملغ النشاط caseinase، 2.16 U / ملغ النشاط clostripain و 0.48 U / ملغ النشاط زيتية (الكثير # 49H11338).

الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء الموضح في هذه المخطوطة يمكن أن تستخدم في غضون 8 الموارد البشرية لدراسات التصحيح، المشبك، كا ^{2 +} قياسات عابرة ومزيج من الاثنين معا. ¹⁵ وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الخلايا القياسات من الانكماش الخلوية في استجابة لتحفيز الحقل الكهربائي أو التحفيز الكهربائي باستخدام ماصة التصحيح، المشبك (الملاحظات غير منشورة).

Materials

			Transport solution
Albumin	Sigma-Aldrich	A3059	Storage solution: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	Transport solution: 30
DL-b-Hydroxy-butyric acid	Sigma-Aldrich	H6501	Storage solution: 10
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251	Storage solution: 70
KCl	Merck	1049360250	Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100
Taurin	Sigma-Aldrich	86330	Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10
Collagenase I	Worthington	4196	Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*
pH			Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40
adjusted with			Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH
			Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.
			Table I. Solutions.
	Company	Catalogue number
Nylon mesh (200 μm)	VWR-Germany	510-9527
Jacketed reaction beaker	VWR	KT317000-0050
			Table II. Specific equipment.
	Company	Catalogue number
Dimethyl-sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM (special packaging)	Invitrogen	F-1242
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
			Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.
	Company	Catalogue number	Bath solution
4-aminopyridine*	Sigma-Aldrich	A78403	Bath solution: 5
BaCl2*	Sigma-Aldrich	342920	Bath solution: 0.1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	Bath solution: 2
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Bath solution: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Bath solution: 10
KCl	Merck	1049360250	Bath solution: 4
MgCl × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	Bath solution: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Bath solution: 140
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761	Bath solution: 2
pH			Bath solution: 7.35
adjusted with			Bath solution: 1 M HCl
			Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.
	Company	Catalogue number	Pipette solution
DL-aspartat K+-salt	Sigma-Aldrich	A2025	Pipette solution: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Pipette solution: 0.02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	Pipette solution: 0.1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Pipette solution: 10
KCl	Merck	1049360250	Pipette solution: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Pipette solution: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Pipette solution: 4
Fluo-3**	Invitrogen	F3715	Pipette solution: 0.1
pH			7.20
adjusted with			1 M KOH
			Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.