सीए के एक साथ माप के लिए मानव आलिंदी myocytes का अलगाव<sup> 2</sup> यात्रियों और झिल्ली धाराओं
Summary
हम intracellular सीए के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो मानव आलिंद myocytes के अलगाव का वर्णन<sup> 2</supElectrophysiological पैच दबाना अध्ययन के साथ संयोजन में> माप.
Abstract
पैच दबाना तकनीक और हृदय सेलुलर 2 सीए के अन्वेषण के साथ हृदय आयन चैनल के electrophysiological गुणों का अध्ययन + निपटने असामान्यताएं अलग cardiomyocytes की आवश्यकता है. इसके अलावा, इन तकनीकों का उपयोग कर रोगियों से myocytes की जांच करने की संभावना ऐसे अलिंद (वायुसेना) के रूप में हृदय रोगों की आणविक आधार को स्पष्ट करने के लिए एक अमूल्य आवश्यकता है. यहाँ 1 हम दोनों के लिए उपयुक्त हैं जो मानव आलिंद myocytes के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन पैच दबाना पढ़ाई और intracellular सीए 2 + सांद्रता का एक साथ माप. सबसे पहले, ओपन हार्ट सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त सही आलिंद उपांग छोटे ऊतक हिस्सा ("हिस्सा विधि") में कटा और + मुक्त समाधान 2 सीए में धो रहे हैं. तब ऊतक मात्रा 20 माइक्रोन सीए 2 + के साथ समाधान युक्त collagenase और प्रोटीज में पचा रहे हैं. इसके बाद अलग myocytes harve हैंऊतक निलंबन की निस्पंदन और centrifugation द्वारा sted. अंत में, सेल भंडारण समाधान में सीए 2 + एकाग्रता 0.2 मिमी तक चरणबद्ध निकाला जाता है. हम संक्षेप + और सीए 2 + अलगाव की प्रक्रिया के दौरान बफरिंग और भी कार्रवाई क्षमता और झिल्ली धाराओं के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग प्रदान करते हैं, दोनों एक साथ एक साथ सीए 2 + क्षणिक माप, इन अलग myocytes में प्रदर्शन के साथ 2 सीए के अर्थ पर चर्चा की.
Introduction
पैच दबाना तकनीक और + हैंडलिंग असामान्यताएं अलग cardiomyocytes की आवश्यकता सेलुलर 2 सीए के अन्वेषण के साथ हृदय आयन चैनल के electrophysiological गुणों का अध्ययन. ये आमतौर पर पाचन एंजाइमों को हृदय के ऊतकों के नमूनों की इन विट्रो जोखिम (collagenase, hyaluronidase, पेप्टिडेज़ आदि) के बाद प्राप्त कर रहे हैं. 1955 2 में व्यवहार्य हृदय myocytes के अलगाव की पहली रिपोर्ट के बाद से प्रोटोकॉल की एक बड़ी मात्रा माउस, चूहे, खरगोश, कुत्ता, गिनी पिग और मानव सहित विभिन्न प्रजातियों में से एक आलिंद और निलय cardiomyocytes की फसल के लिए आदेश में विकसित किया गया है. इस समीक्षा में हम मानव आलिंद myocytes के अलगाव पर ध्यान देते हैं. हम वर्थिंगटन बायोकेमिकल कार्पोरेशन, संयुक्त राज्य अमेरिका (द्वारा प्रदान "वर्थिंगटन ऊतक हदबंदी गाइड 'का उल्लेख करने के अन्य प्रजातियों से myocytes के अलगाव के लिए प्रक्रियाओं के बारे में www.tissuedissociation.com ).
<p class= "Jove_content"> मानव आलिंद myocyte अलगाव प्रोटोकॉल आम तौर पर यहाँ हम क्रम में पहले प्रकाशित विधि से अनुकूलित है जो एक तकनीक का एक कदम दर कदम विवरण, प्रदान बस्टामेंटे, एट अल. 3 से वर्णित विधि से प्राप्त कर रहे हैं पैच दबाना प्रयोगों के लिए, लेकिन यह भी एक साथ intracellular सीए 2 + मापन के लिए न केवल उपयुक्त आलिंद myocytes प्राप्त करते हैं. 4-11Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम खुले दिल की सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त सही आलिंद उपांग से मानव आलिंद myocytes के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन है. साइटोसोलिक सीए 2 की माप के लिए इन myocytes उपयोग करने के लिए + हम भंडारण समाधान से EGTA omitting द्वारा एक पहले से वर्णित विधि 4-11 रूपांतरित किया.
पहले से ही 1970 में यह myocytes + पाचन के दौरान 2 सीए की उपस्थिति में अलग कर देना है, हालांकि उनमें से सब इसलिए contracture और अलाभकारी. 16,17 में थे कि मनाया गया, सेल अलगाव सीए 2 + मुक्त समाधान में किया जाता है. हालांकि, 2 सीए के शारीरिक सांद्रता की फिर से शुरूआत + तेजी सीए 2 + में बाढ़ और कोशिका मृत्यु हुई. यह मूल रूप से Zimmerman और Hulsman द्वारा perfused दिलों में मनाया गया, जिसमें सीए 2 + विरोधाभास घटना के रूप में वर्णित किया गया है. 7.0 पीएच की कमी, सहित अलगाव मीडिया के 18 संशोधनों <taurin 20 का या सीए 2 + (3.2 कदम और 4.1 देखें), 21 के साथ ही भंडारण समाधान 22 युक्त EGTA में पृथक myocytes के भंडारण की थोड़ी मात्रा के> 19 अतिरिक्त समर्थन सीए 2 + विरोधाभास. 17 को रोकने के लिए सुझाव दिया गया है हालांकि, यह अच्छी तरह से सीए 2 + EGTA माध्यम बफरिंग एल प्रकार 2 सीए के आयाम + वर्तमान प्रेरित सीए 2 + क्षणिक आयाम और सीए 2 + यात्रियों की एक Biphasic क्षय में परिणाम कम कर देता है कि जाना जाता है. 23 इसलिए, हम EGTA लोप विशिष्ट गुण और monophasic decays के साथ सीए 2 + यात्रियों को प्राप्त करने के क्रम में पूरे अलगाव प्रक्रिया के दौरान. सीए 2 से कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए + विरोधाभास हम 0.2 मिमी तक एक चरणबद्ध तरीके से भंडारण समाधान के अंतिम सीए 2 + एकाग्रता में वृद्धि हुई.
collagenase के चुनाव शायद सफल myocyte अलगाव के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है. पारंपरिक महाagenases क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से प्राप्त कच्चे तेल की तैयारी कर रहे हैं और अन्य proteinases, polysaccharidases और lipases के एक नंबर के अलावा collagenase होते हैं. उनके सामान्य संरचना collagenases के आधार पर विभिन्न प्रकार में विभाजित किया जाता है. 24 वर्थिंगटन collagenase प्रकार मैं और द्वितीय सफलतापूर्वक हमारे वर्तमान में वर्णित प्रोटोकॉल में मानव आलिंद myocytes से अलगाव. 4-10,15,25-30 के लिए इस्तेमाल किया गया है हम collagenase के इस्तेमाल की सिफारिश हम भी collagenase प्रकार द्वितीय का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की स्वीकार्य मात्रा में प्राप्त करने में सक्षम थे, हालांकि मैं टाइप करें. हालांकि, एक भी collagenase प्रकार के भीतर एंजाइम की गतिविधियों के बारे में एक महत्वपूर्ण बैच को बैच भिन्नता है. इन बदलावों सावधान बैच चयन और अलगाव की प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए विभिन्न बैचों के परीक्षण की आवश्यकता होती है. वर्थिंगटन बायोकेमिकल कार्पोरेशन (से ऑनलाइन उपलब्ध बैच चयन उपकरण http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) मानव आलिंद myocytes के अलगाव के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया है कि एक रचना के साथ उपलब्ध बैचों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान में हम collagenase 250 यू / मिलीग्राम collagenase गतिविधि, 345 यू / मिलीग्राम caseinase गतिविधि, 2.16 यू / मिलीग्राम clostripain गतिविधि और 0.48 यू / मिलीग्राम tryptic गतिविधि (बहुत # 49H11338) के साथ मैं प्रकार का उपयोग करें.
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त कोशिकाओं पैच दबाना पढ़ाई, सीए 2 + क्षणिक माप और इसके अलावा दोनों. 15 का एक संयोजन के लिए 8 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है, इन कोशिकाओं को बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के जवाब में सेलुलर संकुचन की माप की अनुमति या बिजली उत्तेजना पैच दबाना पिपेट (अप्रकाशित टिप्पणियों) का उपयोग कर.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In addition, we thank the cardiac surgeons at Heidelberg University for the provision of human atrial tissue and Claudia Liebetrau, Katrin Kupser and Ramona Nagel for their excellent technical support. Special thanks also to Andy W. Trafford for his helpful suggestions and advice during the establishment of the Ca2+ transient measurements. The authors wish to express their deepest gratitude to the members of the Department of Pharmacology and Toxicology (head: Ursula Ravens) of the Dresden University of Technology for the opportunity they offered us to learn basic techniques and skills in cellular electrophysiology and cardiomyocyte isolation.
The authors’ research is supported by the German Research Foundation (Do769/1-1-3), the German Federal Ministry of Education and Research through the Atrial Fibrillation Competence Network (01Gi0204) and the German Centre for Cardiovascular Research, the European Union through the European Network for Translational Research in Atrial Fibrillation (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, large-scale integrating project, Proposal No. 261057) and the European-North American Atrial Fibrillation Research Alliance (ENAFRA) grant of Fondation Leducq (07CVD03).
The schematic overview shown in the video file was produced using Servier medical art.
Materials
| Transport solution | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
| BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
| DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
| Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
| Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
| Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
| pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
| adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
| Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
| Table I. Solutions. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
| Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
| Table II. Specific equipment. | |||
| Company | Catalogue number | ||
| Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
| Company | Catalogue number | Bath solution | |
| 4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
| BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
| CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
| MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
| pH | Bath solution: 7.35 | ||
| adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
| Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
| Company | Catalogue number | Pipette solution | |
| DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
| GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
| KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
| Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
| pH | 7.20 | ||
| adjusted with | 1 M KOH | ||
| Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||
References
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