Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand
Summary
CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
Abstract
CD4 + regulerende T cellen (Tregs) zijn krachtige immuun modulatoren en dienen een belangrijke functie in het menselijk immuun homeostase. Uitputting van Tregs heeft geleid tot meetbare toename in antigeen-specifieke T cel responsen in vaccins instellingen voor kanker en infectieuze pathogenen. Hun rol in HIV-1 immuno-pathogenese blijft controversieel, aangezien ze ofwel kunnen dienen om schadelijke HIV-1 geassocieerde immuun activering te onderdrukken en dus HIV-1 ziekteprogressie vertragen of alternatief onderdrukken HIV-1-specifieke immuniteit en daarmee virus bevorderen verspreid. Begrijpen en moduleren Treg functie in de context van HIV-1 kan leiden tot potentiële nieuwe strategieën voor immunotherapie of HIV-vaccins. Echter, belangrijke kwesties blijven hun rol in de context van HIV-1 infectie, die zorgvuldig moet worden bestudeerd.
Ruwweg 5% van de menselijke CD4 + T-cellen in het perifere bloed, het bestuderen van de Treg populatie moeilijk gebleken, es teVOORAL in HIV-1 geïnfecteerde individuen waarbij HIV-1-geassocieerde CD4 T-cel en dat Treg uitputting optreedt. De karakterisering van regulerende T-cellen bij patiënten met gevorderde HIV-1 ziekte of weefselmonsters, die op zeer kleine biologische monsters kunnen worden verkregen, is daarom zeer uitdagend. We stellen een technische oplossing voor deze beperkingen te overwinnen met isolatie en expansie van Tregs van HIV-1-positieve individuen.
Hier beschrijven we een eenvoudige en robuuste methode succesvol breiden Tregs geïsoleerd uit HIV-1-geïnfecteerde individuen in vitro. Flow-gesorteerd CD3 + CD4 + CD25 + CD127 vanaf Tregs werden gestimuleerd met anti-CD3/anti-CD28 beklede kralen en gekweekt in aanwezigheid van IL-2. De uitgebreide Tregs uitgedrukt hoge niveaus van FOXP3, CTLA4 en HELIOS vergelijking met conventionele T-cellen en werden getoond om zeer onderdrukkende. Gemakkelijker toegang tot grote aantallen Tregs kunnen de onderzoekers de i te pakkenELANGRIJKE vragen over hun rol in HIV-1 immuunpathogenese. Wij geloven dat het beantwoorden van deze vragen kunnen nuttige inzichten voor de ontwikkeling van een effectieve HIV-1 vaccin.
Introduction
Met meer dan 34 miljoen mensen die leven met hiv / aids wereldwijd en naar schatting 2,5 miljoen mensen besmet in 2011, de noodzaak van een effectieve hiv-vaccin om de wereldwijde hiv-epidemie te beteugelen blijft primordiaal. Echter, ondanks drie decennia van intensieve onderzoeksinspanningen, het HIV-1 vaccin werkzaamheid studies tot op heden hebben geleid tot slechts een bescheiden bescherming 1-3 en de correlaten van protectieve immuniteit blijft slecht begrepen. Ophelderen van de aard van de immuunrespons nodig is voor bescherming is essentieel voor de strategische ontwerp van een effectieve HIV-1-vaccin en andere immunotherapeutische strategieën tegen HIV-1 infectie.
Natuurlijke CD4 + regulerende T-cellen (Tregs) kritisch zijn voor de handhaving van immuuncel homeostase door het regelen overmatige immuunactivatie aldus beperkt immuun-bemiddelde weefselschade. Ze kunnen echter ook onderdrukken immuunrespons tegen pathogenen en voorkomen dat hun klaring. Kanker en Hepatitis B vaccin studies hebben aangetoond dat het verminderen van de activiteit van Tregs kan vaccinrespons en antigeen-specifieke immuniteit tegen virussen 4-7 verbeteren. In de context van HIV-1 infectie, het exacte effect van regulatoire T cellen blijft onvolledig begrepen. Tregs bleken virusreplicatie afname in geactiveerde T-cellen 8 en mogelijk invloed immuunactivatie 9. Tevens werd aangetoond dat HIV-1-specifieke immuunreacties, die negatieve resultaten voor ziekteprogressie 10,11 konden onderdrukken. Aldus alvorens te kunnen Treg activiteit om de doeltreffendheid van een HIV-1-vaccin verbeteren moduleren, is het van belang om meer inzicht te krijgen in hun functie in deze context ziekte.
Human CD4 + regulerende T-cellen relatief schaars celpopulatie, die ongeveer 5% van CD4 + T-cellen in het perifere bloed en de absolute aantallen verdere daling met HIV-geassocieerde CD4 + T cel depletie 12 </ Sup>. Voor deze assays voor Treg functie, zoals T-cel proliferatie assays ervan met Treg co-cultuur, gebruik relatief grote celaantallen 12. Daarom is het karakteriseren van de functie en specificiteit van regulatoire T-cellen bij mensen met gevorderde HIV-1 ziekte is uitdagend, ondanks hun belang voor HIV pathogenese.
De ex vivo isolatie en expansie van Tregs van HIV-1 patiënten kan een oplossing om sommige van deze beperkingen te overwinnen vertegenwoordigen. Hier een eenvoudig en robuust protocol uit te breiden functionele Tregs afgeleid van HIV-1 geïnfecteerde personen in vitro beschrijven we; we nader uitleggen hoe fenotype hen en testen hun onderdrukkende functie met behulp van flowcytometrische analyses. Wij geloven dat dit protocol zal de toegang tot Tregs te vergemakkelijken en te helpen begrijpen van hun rol in de HIV-1 ziekteprogressie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Materials
| Reagents | |||
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
| FlowJo | Tree Star | v887 |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
