כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-
Summary
CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
Abstract
CD4 + תאי T רגולטוריים (Tregs) הם מאפננים חיסוניים חזקים ולשרת את התפקיד חשוב בומאוסטזיס חיסון האנושי. דלדול של Tregs הוביל לעליות מדידים בתגובות תא T אנטיגן ספציפיות בהגדרות חיסון לסרטן ופתוגנים זיהומיות. עם זאת, תפקידם בנגיף HIV-1 חיסוני הפתוגנזה נותר שנוי במחלוקת, כפי שהם יכולים גם לשמש כדי לדכא את ההפעלה חיסונית HIV-1-משויכת מזיקה ובכך להאט HIV-1 התקדמות מחלה או לחלופין לדכא את חסינות HIV-1-ספציפית ובכך לקדם את הווירוס להתפשט. הבנה ותפקוד Treg ויסות בהקשר של HIV-1 עשויה להוביל לאסטרטגיות חדשות פוטנציאליות לטיפול חיסוני או חיסונים נגד איידס. עם זאת, שאלות פתוחות חשובות להישאר בתפקידם בהקשר של זיהום HIV-1, אשר צריך להיחקר בזהירות.
המייצג כ -5% מסוג CD4 + T תאי אדם בדם ההיקפי, לומד אוכלוסיית Treg הוכיח להיות קשה, especially בHIV-1 אנשים נגועים בו T מסוג CD4 תאים HIV-1 קשור ועם זה דלדול Treg מתרחש. האפיון של תאי T רגולטוריים באנשים עם HIV מתקדם 1-מחלה או דגימות רקמה, שעבורו ניתן להשיג דגימות ביולוגיות קטנות מאוד בלבד, ולכן היא מאוד מאתגר. אנו מציעים פתרון טכני כדי להתגבר על מגבלות אלה באמצעות בידוד והרחבת Tregs מאנשים HIV-1-חיוביים.
כאן אנו מתארים שיטה קלה וחזקה כדי להרחיב Tregs המבודד בהצלחה מאנשים HIV-1 נגוע-במבחנה. זרימה מסודרים CD3 + CD4 + CD25 + CD127 הנמוך Tregs היה מגורה עם anti-CD3/anti-CD28 חרוזים מצופים ותרבית בנוכחות של IL-2. המורחב Tregs הביע רמות גבוהות של FOXP3, CTLA4 והליוס בהשוואה לתאי T קונבנציונליים והוצג להיות מדכא מאוד. גישה קלה יותר למספר גדול של Tregs תאפשר לחוקרים לכתובת שאנישאלות הנוגעות לתפקידם mportant בimmunopathogenesis HIV-1. אנו מאמינים לענות על שאלות אלה עשויים לספק תובנות מועילות לפיתוח של חיסון יעיל HIV-1.
Introduction
עם יותר מ 34 מיליון אנשים חיים עם HIV / איידס ברחבי העולם ושל 2.5 מיליון בני אדם נדבקו לאחרונה בשנת 2011, את הצורך בחיסון ל-HIV יעיל לבלום את מגיפת האיידס ברחבי העולם נותרת בעל חשיבות עליונה. עם זאת, למרות שלושה עשורים של מאמצי מחקר אינטנסיביים, HIV-1 בניסויים יעילות החיסון עד כה הביאו רק 1-3 הגנה וצנועות וקושרת של חסינות תישאר הבינה היטב. הבהרת טיבה של התגובה החיסונית זקוקה להגנה היא חיונית לעיצוב האסטרטגי של חיסון ל-HIV-1 יעיל ואסטרטגיות immunotherapeutic אחרות מיקוד הידבקות ב-HIV-1.
CD4 הטבעי + תאי T רגולטוריים (Tregs) הם קריטי לשמירה על הומאוסטזיס תא חיסון על ידי שליטה בהפעלת מערכת החיסונית מוגזמת, וכך להגביל את נזק לרקמות חיסונית בתיווך. עם זאת, הם יכולים גם לדכא את התגובה חיסונית נגד פתוגנים ולמנוע הפינוי שלהם. הסרטן וHepaמחקרי חיסון B titis הוכיחו כי הפחתת הפעילות של Tregs יכולה לשפר את תגובת חיסון ואנטיגן ספציפית לחסינות מפני וירוסים 4-7. עם זאת, בהקשר של זיהום HIV-1, את ההשפעה של תאי T רגולטוריים המדויקת נשארה הבינה באופן חלקי. Tregs הראו ירידה בשכפול נגיף מופעל תאי T 8 ואולי להשפיע על הפעלת מערכת החיסונית 9. הם הוצגו גם כדי לדכא את התגובה חיסונית של HIV-1-ספציפית, שיש בם תוצאות שליליות להתקדמות מחלה 10,11. לכן, לפני שהוא מסוגל לווסת את פעילות Treg כדי לשפר את היעילות של חיסון HIV-1, זה חשוב כדי לקבל תובנה נוספת לתוך תפקידם בהקשר מחלה זו.
סוג CD4 + אדם תאי T רגולטוריים הם אוכלוסיית תאים נדירה יחסית, המהווה כ 5% מסוג CD4 + T תאים בדם ההיקפי, ומספרים נוספים עם ירידת CD4-HIV הקשורים + T דלדול תא 12 המוחלטים </ Sup>. מבחני הנוכחיים להערכת תפקוד Treg, כגון מבחני התפשטות תאי T עם Treg התרבות משותפת, השתמשו במספרי תא גדולים יחסית 12. לכן, אפיון פונקציה וספציפיות של תאי T רגולטוריים באנשים עם HIV-1 מתקדם מחלה כבר מאתגרת, למרות חשיבותם לפתוגנזה HIV.
הבידוד לשעבר vivo והרחבת Tregs מחולי HIV-1 יכולים לייצג פתרון כדי להתגבר על חלק ממגבלות אלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול קל וחזק כדי להרחיב Tregs התפקודי נגזר מHIV-1 אנשים נגועים במבחנה; אנחנו עוד מסבירים כיצד פנוטיפ אותם ולבדוק את התפקוד המדכא שלהם באמצעות מבחני cytometric זרימה. אנו מאמינים פרוטוקול זה יקל על גישה לTregs ועזרה בהבנת תפקידם בהתקדמות המחלה HIV-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Materials
| Reagents | |||
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
| FlowJo | Tree Star | v887 |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
