Separasjon av Mouse Embryonic Facial ektoderm og mesenchyme

Summary

En protokoll for separasjon av embryo ansikts ektoderm og mesenchyme er beskrevet. Vi bruker Dispase II til å behandle hele embryoer først, dissekere hele ansikts prominenser ut, og deretter skille ansikts ektoderm og mesenchyme.

Abstract

Orofacial kløfter er de hyppigste kraniofaciale defekter som påvirker 1,5 i 1000 nyfødte på verdensbasis ^1,2. Orofacial clefting er forårsaket av unormal ansikts utvikling ^3. Hos menneske og mus, innledende vekst og mønster av ansiktet avhengig flere små knopper av vev, ansikts prominenser ^4,5. Ansiktet er avledet fra seks viktigste prominenser: sammenkoblede frontal nasal prosesser (FNP), overkjevens prominenser (MXP) og underkjevens prominenser (MDP). Disse prominenser består av hevelser i mesenchyme som er innkapslet i en overliggende epitel. Studier i flere arter har vist at signaliserer crosstalk mellom ansikts ektoderm og mesenchyme er kritisk for å forme ansiktet ^6. Likevel er mekanistiske detaljer om gener som er involvert i disse signaliserer releer mangler. En måte å få en helhetlig forståelse av genekspresjon, transkripsjonsfaktor bindende, og kromatin merker forbundet med utvikledeping ansikts ektoderm og mesenchyme er å isolere og karakterisere de atskilte vev avdelinger.

Her presenterer vi en metode for å skille ansikts ektoderm og mesenchyme på embryonale dag (E) 10,5, en kritisk utviklingsstadiet i mus ansikts formasjon som står foran fusjon av prominenser. Vår metode er tilpasset fra den tilnærmingen vi tidligere har brukt for å dissekere ansikts prominenser ^7. I denne tidligere studie hadde vi ansatt innavlet C57BL / 6 mus som denne belastningen har blitt en standard for genetikk, genomikk og ansikts morfologi ^8. Her, skjønt, på grunn av mer begrensede mengder vev tilgjengelig, har vi utnyttet outbred CD-en belastning som er billigere å kjøpe, mer robust for reindrift, og tending å produsere flere embryoer (12-18) per kull enn noen innavlede mus stamme ^8. Etter embryo isolasjon, ble nøytral protease Dispase II brukes til å behandle hele embryo. Deretter ble ansikts prominenser dissekereed ut, og ansikts ektoderm ble skilt fra mesenchyme. Denne metoden holder både ansikts ektoderm og mesenchyme intakt. Prøvene oppnådd ved hjelp av denne metodikken kan brukes for teknikker inkludert protein deteksjon, kromatin immunoutfelling (chip) assay, mikromatriser studier, og RNA-seq.

Protocol

1. Forbered Dispase II Tilberede ferske Hepes-bufret saltvann (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Tilsett 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 og 1,2 ml 2,5 M NaCl i 16,8 ml Ultrapure H 2 O. Gjør 10 mg / ml Dispase II. Vei 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) og oppløses i 20 ml HBS. Forbered 1,0 ml alikvoter i enkelte Eppendorf-rør og oppbevar ved -20 ° C for langtidslagring. Fortynn 10 mg / ml Dispase II 1:10 i PBS før bruk. Sett utvannet Dispase II på isen. </…

Representative Results

Etter Dispase II behandling, har en tendens ektoderm av embryoet å være løs. Ansikts prominenser skal være intakt etter disseksjon (figur 2A). Den isolerte ansikts ektoderm er klar og fri for mesenchyme vev (figur 2B). Å bestemme effekten av protokollen, og å oppdage krysskontaminering vi analysert for forebrain uttrykt Zic3 9, ectodermal spesifikk cdh1 5 og mesenchymale spesifikk sox10 10 bruker revers transkriptase PCR. Våre studier bekreftet at…

Discussion

Denne protokollen gir en grei metode for å skille embryonale mus ansikts ektoderm og mesenchyme basert på en første Dispase II behandling trinn. I tidligere studier har vi utført disseksjon av ansikts prominenser før Dispase II behandling, men vi har stadig funnet at mesenchyme blir "sticky" og vanskeligere å manipulere. Vår nye protokollen eliminerer dette problemet. Kombinasjon Dispase II behandling med mild fysisk makt ved å pipettere opp og ned gjør separasjon av ektoderm og mesenchyme enklere. Vi…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II (neutral protease, grade II)	Roche	4942078001	Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C .
RNAlater	Ambion	AM7021