Adskillelse af muse embryonale Facial ektoderm og mesenkym

Summary

En protokol til adskillelse af foster facial ektoderm og mesenkym er beskrevet. Vi bruger Dispase II til behandling af hele embryoner først, dissekere hele ansigtet Fremspring ud, og derefter adskille facial ektoderm og mesenkym.

Abstract

Orofacial kløfter er de mest hyppige kraniofaciale defekter, som påvirker 1,5 ud af 1.000 nyfødte på verdensplan ^1,2. Orofaciale clefting er forårsaget af unormal facial udvikling ^3. I human og mus, initial vækst og mønsterdannelse af ansigtet er afhængig af flere små knopper af væv, ansigtets Fremspring ^4,5. Ansigtet er afledt af seks store Fremspring: parrede frontal nasale processer (FNP), kaebe Fremspring (MXP) og mandiblens fremspring (MDP). Disse fremspring består af hævelse af mesenkym der er indkapslet i et overliggende epitel. Undersøgelser hos flere arter har vist, at signalering krydstale mellem facial ektoderm og mesenkym er kritisk for at forme flade ^6. Alligevel er mekanistiske detaljer vedrørende generne involveret i disse signal-relæer mangler. En måde at få en bred forståelse af genekspression, transkriptionsfaktor bindende, og kromatin mærker i forbindelse med udvikping facial ektoderm og mesenkym er at isolere og karakterisere de adskilte væv rum.

Her præsenteres en fremgangsmåde til adskillelse facial ektoderm og mesenkym på fosterdag (E) 10,5, en kritisk udviklingsstadiet i mus facial formation, der går forud for smeltning af Fremspring. Vores metode er tilpasset fra den tilgang, vi tidligere har brugt til dissekering ansigtet Fremspring ^7. I denne tidligere undersøgelse havde vi ansat indavlede C57BL / 6 mus som denne stamme er blevet en standard for genetik, genomforskning og i ansigtet morfologi ^8. Her dog, på grund af de mere begrænsede mængder af væv til rådighed, har vi udnyttet den udavlet CD-1-stamme, der er billigere at købe, mere robust for dyrehold, og har tendens til at producere flere embryoner (12-18) per kuld end nogen indavlet musestamme ^8. Efter embryo isolation blev neutral protease Dispase II til behandling af hele embryo. Derefter blev facial Fremspring dissekereed ud, og den facial ektoderm blev separeret fra mesenkym. Denne metode holder både ansigts ektoderm og mesenkym intakt. Prøverne opnået under anvendelse af denne metode kan anvendes til teknikker, herunder proteindetektion, chromatin immunoprecipitation (chip) assay, microarray undersøgelser, og RNA-seq.

Protocol

1. Forbered Dispase II Fremstilles frisk Hepes-pufret saltvand (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCI). Tilsæt 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 og 1,2 ml 2,5 M NaCl i 16,8 ml ultrarent H 2 O. Lav 10 mg / ml Dispase II. Afvej 0,2 g Dispase II (Roche, Cat # 4942078001) og opløses i 20 ml HBS. Forbered 1,0 ml aliquots i individuelle Eppendorf-rør og opbevares ved -20 ° C for langtidsopbevaring. Fortynd 10 mg / ml Dispase II 1:10 i PBS før brug. Sæt den fortyndede Dispase I…

Representative Results

Efter Dispase II behandling tendens til, at ectoderm af embryonet til at være løst. Ansigtets fremspring skal være intakt efter dissektion (figur 2A). Det isolerede facial ektoderm er klar og fri for mesenkym væv (figur 2B). For at bestemme effektiviteten af protokollen og for at opdage krydskontaminering vi analyseret for forhjerne udtrykte Zic3 9, ectodermal specifik CDH1 5 og mesenchymal specifik sox10 10 under anvendelse af revers transkriptase P…

Discussion

Denne protokol giver en enkel metode til at skille embryonale muse facial ektoderm og mesenkym baseret på en initial Dispase II behandlingstrin. I tidligere undersøgelser er der udført dissektion af ansigtets Fremspring før Dispase II behandling, men vi konsekvent har vist sig, at mesenkym bliver "klæbrige" og vanskeligere at manipulere. Vores nye protokol undgår dette problem. Kombinationen Dispase II behandling under forsigtig fysisk kraft ved at pipettere op og ned gør adskillelse af ektoderm og mese…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II (neutral protease, grade II)	Roche	4942078001	Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C .
RNAlater	Ambion	AM7021