הפרדת אקטודרם עכבר העוברי פן וmesenchyme
Summary
פרוטוקול להפרדה של אקטודרם וmesenchyme פן עובר מתואר. אנו משתמשים Dispase השני לטיפול בעוברים שלמים ראשון, לנתח בליטות פן שלמות, ואז להפריד אקטודרם וmesenchyme הפנים.
Abstract
בתרי Orofacial הם מומי Craniofacial השכיחים ביותר, אשר משפיעים על 1.5 ב1,2 1,000 תינוקות ברחבי העולם. clefting Orofacial נגרם על ידי 3 פיתוח פנים לא נורמלים. באדם ובעכבר צמיחה, ראשונית ודפוסים של הפנייה מסתמך על מספר קטנות של רקמת בלוטות, את בליטות פן 4,5. הפנים נגזרו משש בליטות עיקריות: תהליכי אף קדמיים לזווג (FNP), בליטות לסת עליונות (MXP) ובליטות בלסת תחתונה (MDP). בליטות אלה מורכבות מנפיחויות של mesenchyme שנארזות האפיתל שמעליה. מחקרים במינים רבים הראו כי איתות דיבור בין אקטודרם וmesenchyme פנים היא קריטית לעיצוב פני 6. עם זאת, פרטים הנוגעים מכניסטית של הגנים המעורבים בממסרי איתות אלה חסרים. אחת דרכים להגיע להבנה מקיפה של ביטוי גנים, גורם שעתוק מחייב, וסימנים הקשורים לכרומטין develoאקטודרם וmesenchyme פן פינג הוא לבודד ולאפיין את תאי רקמות המופרדות.
כאן אנו מציגים שיטה להפרדת אקטודרם וmesenchyme פן ביום עוברי (E) 10.5, שלב ההתפתחותי קריטי בהיווצרות פן עכבר שמקדימה היתוך של הבליטות. השיטה שלנו מותאמת לגישה ששמשנו בעבר לביתור בליטות פן 7. במחקר מוקדם יותר שהעסקנו C57BL לדה / 6 עכברים כזן זה הפך להיות סטנדרט לגנטיקה, גנומיקה והמורפולוגיה של פנים 8. כאן, לעומת זאת, בשל כמויות המוגבלות יותר של רקמה זמינה, יש לנו מנוצלים מתח outbred תקליטור-1 שהוא זול יותר לרכישה, חזק יותר לגידול בעלי, ונוטים לייצר יותר עוברים (12-18) בכל המלטה מאשר כל לדה עכבר זן 8. בעקבות בידוד עובר, פרוטאז ניטראלי Dispase השני שמש לטיפול בכל העובר. ואז, את בליטות פן היו לנתחאד החוצה, ואקטודרם הפנים הופרדו מmesenchyme. שיטה זו שומרת גם אקטודרם וmesenchyme הפנים ללא פגע. הדגימות שהתקבלו באמצעות מתודולוגיה זו יכולה לשמש לטכניקות כוללים זיהוי חלבון, הכרומטין assay immunoprecipitation (שבב), מחקרי microarray, ו-RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה להפריד אקטודרם העוברי עכבר פנים וmesenchyme מבוסס על צעד טיפול ראשוני Dispase השני. במחקרים קודמים, שבוצענו נתיחה של בליטות פן לפני הטיפול השני Dispase, אבל אנחנו עקביים מצאנו כי mesenchyme הופך להיות "דביק" וקשה יותר לתמרון. הפרוטוקול החדש שלנו מונע א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לאיירין צ'וי להמחשת ראשי עובר באיור 1 ושאר חברי המעבדה לעזרה ודיון. עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH DE012728 (TW)
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 – The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. 발생학. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. 발생학. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
