Separation av mus Embryonala Facial ektoderm och mesenkym
Summary
Ett protokoll för separering av embryo ansiktet ektoderm och mesenkym beskrivs. Vi använder Dispase II för att behandla hela embryon först dissekera hela ansiktet protuberanser ut, och sedan separera ansiktet ektoderm och mesenkym.
Abstract
Orofaciala klyftor är de vanligaste kraniofaciala defekter som påverkar 1,5 i 1000 nyfödda i världen 1,2. Orofacial clefting orsakas av onormal ansikts utveckling 3. I människa och mus, första tillväxt och mönstring av ansiktet är beroende av flera små knoppar av vävnad, ansikts protuberanser 4,5. Ansiktet kommer från sex stora protuberanser: parade frontal näsan processer (FNP), maxillary protuberanser (MXP) och mandibular protuberanser (MDP). Dessa protuberanser består av svullnader i mesenkym som är inneslutna i ett överliggande epitel. Studier i flera arter har visat att signalering överhörning mellan ansiktet ektoderm och mesenkym är avgörande för att forma ansiktet 6. Ändå är mekanistiska uppgifter om de gener som är involverade i dessa signalreläerna saknas. Ett sätt att få en övergripande förståelse av genuttryck, transkriptionsfaktor bindande och märken kromatin i samband med utveckping ansiktet ektoderm och mesenkym är att isolera och karakterisera de separerade teoretiska vävnader.
Här presenterar vi en metod för att separera ansiktet ektoderm och mesenkym på embryonala dag (E) 10,5, en kritisk utvecklingsstadium i mus ansiktet formation som föregår sammansmältning av protuberanser. Vår metod är anpassad från den strategi som vi har tidigare använts för dissekera ansiktet protuberanser 7. I denna tidigare studie hade vi anställda inavlade C57BL / 6 möss som denna stam har blivit en standard för genetik, genomik och ansikts morfologi 8. Här, men på grund av de mer begränsade mängder vävnad finns, har vi utnyttjat utavlat CD-1-stam som är billigare att köpa, mer robust för djurhållning, och tenderar att producera mer embryon (12-18) per kull än något inavlad musstammen 8. Efter embryo isolering, var neutralt proteas Dispase II används för att behandla hela embryot. Därefter var de ansikts protuberanser dissekeraed ut och ansiktet ektodermet separerades från mesenkym. Denna metod håller både ansiktet ektoderm och mesenkym intakt. De prover som erhölls med denna metod kan användas för tekniker inklusive protein upptäckt, kromatin immunoprecipitation (chip)-analys, microarray studier och RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger en enkel metod för att separera embryonala mus ansiktet ektoderm och mesenkym baserat på en initial Dispase II behandling steg. I tidigare studier har vi utfört dissektion av ansikts protuberanser före Dispase II behandling, men vi har konsekvent funnit att mesenkym blir "klibbiga" och svårare att manipulera. Vår nya protokollet undviker detta problem. Kombination Dispase II behandling med mild fysisk kraft genom att pipettera upp och ned gör separation av ektoderm och mesenkym lätt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Irene Choi för att illustrera embryo huvuden i figur 1 och de övriga medlemmarna i laboratoriet för att få hjälp och diskussion. Detta arbete stöds av NIH bidrag DE012728 (TW)
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 – The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. 발생학. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. 발생학. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
