الزرد هي نظام لنمذجة الاضطرابات الناشئة الإنسان من العضلات والهيكل العظمي. نحن تصف طريقة سريعة وفعالة لعزل myofibers العضلات والهيكل العظمي من الزرد الجنينية واليرقات. هذه الطريقة تعطي عالية الكثافة إعداد ليف عضلي مناسبة لدراسة مورفولوجية واحد من الألياف العضلات والهيكل العظمي، والبروتين توطين التحت خلوية، وعلم وظائف الأعضاء العضلات.
وقد ثبت الزرد أن يكون نظام نموذجا قيما لاستكشاف وظيفة العضلات والهيكل العظمي والعضلات لدراسة الأمراض البشرية. على الرغم من العديد من المزايا التي تقدمها في الجسم الحي تحليل الهيكل العظمي والعضلات في الزرد، تصور معقد ومنظم بدقة البروتين الوسط مسؤولة عن وظيفة العضلات، وخصوصا في الأجنة كله، يمكن أن يكون مشكلة. ينبع هذا عائق من صغر حجم العضلات والهيكل العظمي الزرد (60 ميكرون)، وحجم أصغر من قسيم عضلي. نحن هنا وصف وشرح طريقة بسيطة وسريعة لعزل myofibers الهيكل العظمي من الأجنة الزرد واليرقات. نحن تشمل أيضا البروتوكولات التي توضح تقنيات إعداد المنصب مفيدة لتحليل بنية العضلات وظيفة. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل توطين immunocytochemical اللاحقة للبروتينات العضلات والهيكل العظمي والتحليل النوعي لإطلاق الكالسيوم عبر حفز التصوير الكالسيوم الخلية الحية. عموما، هذا الفيديوتنص المادة طريقة مباشرة إلى الأمام وكفاءة لعزل وتوصيف myofibers الهيكل العظمي الزرد، وهو الأسلوب الذي يوفر ممرا للدراسات اللاحقة لا تعد ولا تحصى من بنية العضلات وظيفة.
العضلات والهيكل العظمي هو النسيج درجة عالية من التخصص مسؤولة عن توليد القوى مقلص اللازمة لحركية. يبدأ الانكماش من خلال عملية تعرف باسم الإثارة الانكماش (EC) اقتران الذي يحول الإشارات الكهربائية إلى إطلاق الكالسيوم من مخازن داخل الخلايا 1،2. الافراج الكالسيوم داخل الخلايا ينشط قسيم عضلي لتقصير وتوليد القوة. والعديد من مكونات محددة من الآلات الجزيئية المسؤولة عن التوسط انتقال العصبية والعضلية تقاطع 3، EC اقتران 4،5، وأكتين-الميوسين تقلصات تعتمد 6 الاستمرار في أن تكون موضوع بحث مكثف الجارية. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد البروتينات التي استقرار غشاء العضلات خلال 7،8 الانكماش والتي تتوسط بين إشارات ليف عضلي والمصفوفة خارج الخلية 7،9 ودرس بقدر كبير من التفصيل.
الطفرات في عدد من الجينات الهامة للبنية العضلاتوقد تم تحديد وظيفة الثانية كأسباب للأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري ( http://www.musclegenetable.org/ ). هذه الأمراض، تصنيفها كما الاعتلالات العضلية الهيكلية وضمور العضلات على أساس الخصائص السريرية والنسيجية، وترتبط مع ضعف العضلات، والعجز مدى الحياة، و10،11 الوفيات المبكرة. وقد ثبت الزرد أن يكون نظاما غير المسددة لنمذجة ودراسة الأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري 8،12،13. واستخدمت ذلك للتحقق من صحة طفرات جينية جديدة 8، وتحديد جوانب جديدة من الفيزيولوجيا المرضية المرض 14،15، وتحديد النهج العلاجي الجديد 15،16. قوة الزرد لدراسة مرض في العضلات الإنسان يتصل عدد كبير من النسل، والتطور السريع للبنية العضلات وظيفة، والوضوح البصري للجنين الزرد، وسهولة التلاعب الجيني والدوائية للحمار وحشي الناميةالأسماك 17.
نحن وآخرون 12،18،19 قد وضعت في الآونة الأخيرة تقنية بسيطة لعزل السريع والفعال للmyofibers من الزرد النامية. وقد مكنت هذه المنهجية في دراسة myofibers بتفصيل أكبر مما يمكن أن تقدمها تحليل الجنين كله. وقد تم استغلال هذه التقنية لتوصيف البروتين توطين التحت خلوية 20 وكذلك لتحديد الخصائص النسيجية هامة كجزء من دراسات التحقق من الصحة في النماذج المطورة حديثا المرض 21. علاوة على ذلك، يمكن بالإضافة إلى ذلك myofibers المعزولة أن تستخدم للتصوير الحي وللدراسات الكهربية 22، التقنيات التي تسمح للاستجواب الجوانب الرئيسية من وظيفة العضلات. بروتوكول محددة لليف عضلي العزلة، جنبا إلى جنب مع اثنين من الأمثلة من التجارب التحليلية اللاحقة، هو مفصل في الأجزاء المتبقية من هذه المخطوطة.
الزرد هي نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة تنمية العضلات وظيفة في الجسم الحي 25،27،28. ظهرت أنها أيضا رصيدا قيما لنمذجة أمراض العضلات البشرية 14،15،20،29. بينما اتخذت خطوات كبيرة لتعزيز استخدام وتطبيق الزرد لدراسة وظيفة العضلات وأمراض العضلات، وهناك حاجة…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر داولنغ (آرون Reifler، ترينت وو، أنجيلا بوستا، ويليام تيلفر) التي ساهمت في تطوير تقنية وإنتاج المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد توبمان، وقسم طب الأطفال في جامعة ميشيغان، وفي جزء من المنح المقدمة من جمعية الضمور العضلي (JJD MDA186999) والمعاهد الوطنية للصحة (JJD 1K08AR054835).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
24-well culture plate | Corning | 3524 | |
10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
Sheep serum | Sigma | S3772 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
Pronase | Sigma | P5147 | |
40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
Caffeine | Sigma | C0750 |