Analyse av Embryonale og Larvesebrafisk Skeletal myofibers fra Dissosierte Forberedelser
Summary
Sebrafisk er en voksende system for å modellere humane sykdommer i skjelettmuskel. Vi beskriver en rask og effektiv metode for å isolere skjelettmuskel myofibers fra embryo-og larvesebrafisk. Denne metode gir en høy tetthet myofiber preparat egnet for undersøkelse av enkeltskjelettmuskelfiber morfologi, protein subcellulære lokalisering, og muskel-fysiologi.
Abstract
Den sebrafisk har vist seg å være en verdifull modellsystem for å utforske skjelettmuskelfunksjon og for å studere menneskelige muskelsykdommer. Til tross for de mange fordelene som tilbys av in vivo analyse av skjelettmuskulatur i sebrafisk, visualisere komplekse og fint strukturert protein miljø ansvarlig for muskelfunksjonen, særlig i hele embryo, kan være problematisk. Dette hindring stammer fra den lille størrelsen på sebrafisk skjelettmuskulatur (60 mikrometer) og enda mindre størrelse på sarcomere. Her beskriver vi og vise en enkel og rask metode for å isolere skjelett myofibers fra sebrafisk embryo og larver. Vi inkluderer også protokoller som illustrerer legg forberedelse teknikker som er nyttige for å analysere muskel struktur og funksjon. Nærmere bestemt, vi detalj den påfølgende immunocytochemical lokalisering av skjelettmuskelproteiner og kvalitativ analyse av stimulert kalsium utgivelsen via live celle kalsium bildebehandling. Samlet sett denne videoenArtikkelen gir en rett-frem og effektiv metode for isolering og karakterisering av sebrafisk skjelett myofibers, en teknikk som gir en kanal for utallige etterfølgende studier av muskel struktur og funksjon.
Introduction
Skjelettmuskel er et høyt spesialisert vev ansvarlig for å generere de kontraktile krefter som er nødvendige for motilitet. Sammentrekning er initiert gjennom en prosess som kalles eksitasjon-kontraksjon (EF) kobling som konverterer elektriske signaler til kalsium utgivelse fra intracellulære butikker 1,2. Intracellulær kalsium utgivelsen aktiverer sarcomere å forkorte og generere kraft. De mange spesifikke komponenter av molekylære maskiner ansvarlig for formidling av nevromuskulær veikryss overføring 3, EC kopling 4,5, og aktin-myosin avhengige sammentrekninger 6 fortsette å være den pågående gjenstand for intens forskning. I tillegg er proteiner som stabiliserer muskelmembranen under sammentrekning 7,8, og som formidler signalering mellom myofiber og den ekstracellulære matriks 7,9 Det er oppdaget og undersøkt i stor detalj.
Mutasjoner i en rekke gener som er viktige for muskelstruktur ennd funksjon har blitt identifisert som årsaker til menneskelige skjelettmuskelsykdommer ( http://www.musclegenetable.org/ ). Disse sykdommene, klassifisert bredt som skjelett myopatier og muskeldystrofier basert på kliniske og histopatologiske funksjoner, er assosiert med muskelsvakhet, livslang uførhet og tidlig død 10,11. Sebrafisk har vist seg å være en fremragende system for modellering og studere menneskelige skjelettmuskelsykdommer 8,12,13. Det har blitt ansatt for å validere nye genmutasjoner 8, definere nye aspekter av sykdoms patofysiologien 14,15, og identifisere nye terapeutiske tilnærminger 15,16. Kraften av sebrafisk for å studere menneskelig muskel sykdom relatert til det store antall avkom, den raske utviklingen av muskel struktur og funksjon, den optiske klarhet i sebrafisk embryo, og den enkle genetiske og farmakologisk manipulasjon av utviklings sebrafisk 17.
Vi og andre 12,18,19 har nylig utviklet en enkel teknikk for rask og effektiv isolering av myofibers fra utviklingssebrafisk. Denne metodikken har aktivert undersøkelsen av myofibers i større detalj enn det som kan tilbys av hele embryo analyse. Teknikken har vært utnyttet for karakterisering av protein subcellulære lokalisering 20, så vel som for identifisering av histopatologiske viktige egenskaper som en del av valideringsstudier i nyutviklede sykdomsmodeller 21. Videre kan isolerte myofibers i tillegg bli brukt for direkte avbildning og for elektrofysiologiske studier 22, teknikker som gir mulighet for avlesning av de viktigste aspektene av muskelfunksjonen. Den spesifikke protokollen for myofiber isolasjon, sammen med to eksempler på senere analytiske eksperimenter, er detaljert i de resterende delene av dette manuskriptet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebrafisk er en kraftig virveldyr modellsystem for å studere muskelutvikling og funksjon in vivo 25,27,28. De har også dukket opp som en verdifull ressurs for å modellere menneskelige muskelsykdommer 14,15,20,29. Mens store fremskritt har blitt tatt for å fremme bruk og anvendelse av sebrafisk for studier av muskelfunksjon og muskelsykdommer, er det et konstant kritisk behov for å utvikle verktøy som vil tillate mer grundig analyse som compliments genetisk, morfologiske, atferdsmessi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke medlemmene i Dowling lab (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, og William Telfer) som bidro til utviklingen av teknikken og til produksjon av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Taubman institutt, Institutt for pediatri ved University of Michigan, og dels fra tilskudd fra muskeldystrofi Association (JJD MDA186999) og National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
References
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).
- Ohno, K. Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction. Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).
- Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
- Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Barresi, R., Campbell, K. P. Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease. J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).
- Emery, A. E. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey. Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).
- Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. Congenital myopathies: an update. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).
- Bassett, D. I., Currie, P. D. The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy. Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).
- Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5, (2009).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).
- Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Nixon, S. J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).
- Schredelseker, J., et al. The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy. Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).
- Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit. J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhou, W., et al. Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants. Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).
- Hirata, H., et al. accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1. Development. 131, 5457-5468 (2004).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).
- Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres. J. Physiol. 564, 451-464 (2005).
- Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs. Nature. 346, (1990).
- Sakowski, S. A., et al. A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture. J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).
- Nakano, Y., et al. Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation. Development. 137, 1689-1698 (2010).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).
