Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas
Summary
El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.
Abstract
El pez cebra ha demostrado ser un sistema modelo valioso para la exploración de la función del músculo esquelético y para el estudio de enfermedades musculares humanas. A pesar de las muchas ventajas que ofrece el análisis in vivo de los músculos esqueléticos en el pez cebra, visualizando el complejo y finamente estructurada entorno proteína responsable de la función muscular, especialmente en los embriones en su conjunto, puede ser problemático. Este obstáculo se deriva del pequeño tamaño del músculo esquelético pez cebra (60 m) y el tamaño aún más pequeño del sarcómero. Aquí describimos y demostrar un método sencillo y rápido para el aislamiento de miofibras esqueléticas a partir de embriones de pez cebra y larvas. También se incluyen los protocolos que muestran técnicas de correos de preparación útiles para el análisis de la estructura y la función muscular. Concretamente, se detalla la localización inmunocitoquímica posterior de las proteínas del músculo esquelético y el análisis cualitativo de la liberación de calcio estimulado a través de imágenes de calcio de células vivas. En general, este videoartículo proporciona un método sencillo y eficiente para el aislamiento y caracterización de miofibras esqueléticas de pez cebra, una técnica que proporciona un conducto para estudios posteriores miríada de estructura y la función muscular.
Introduction
El músculo esquelético es un tejido altamente especializado responsable de generar las fuerzas contráctiles necesarias para la motilidad. La contracción se inicia a través de un proceso conocido como excitación-contracción (CE) de acoplamiento que convierte las señales eléctricas a la liberación de calcio desde las reservas intracelulares 1,2. La liberación de calcio intracelular activa el sarcómero se acorte y generar fuerza. Los numerosos componentes específicos de la maquinaria molecular responsable de mediar la transmisión unión neuromuscular 3, acoplamiento CE 4,5, y la actina-miosina contracciones dependientes 6 continúan siendo objeto de una intensa investigación en curso. Además, las proteínas que estabilizan la membrana muscular durante 7,8 contracción y que median la señalización entre la miofibras y la matriz extracelular 7,9 se han identificado y estudiado en gran detalle.
Las mutaciones en un número de genes importantes para la estructura de un músculoND función se han identificado como causas de enfermedades del músculo esquelético humanos ( http://www.musclegenetable.org/ ). Estas enfermedades, que se clasifican en términos generales como miopatías esqueléticas y distrofias musculares basados en las características clínicas e histopatológicas, se asocian a debilidad muscular, incapacidad permanente y 10,11 mortalidad temprana. El pez cebra ha demostrado ser un sistema excelente para modelar y estudiar las enfermedades del músculo esquelético humanos 8,12,13. Se ha empleado para validar nuevas mutaciones del gen 8, definir nuevos aspectos de la fisiopatología de la enfermedad 14,15, e identificar nuevos enfoques terapéuticos 15,16. El poder del pez cebra para el estudio de la enfermedad de músculo humano se refiere a la gran cantidad de el rápido desarrollo de la estructura muscular y la función, la claridad óptica del embrión de pez cebra, y la facilidad de manipulación genética y farmacológica de la cebra el desarrollo de la descendencia,pescado 17.
Nosotros y otros 12,18,19 hemos desarrollado recientemente una técnica simple para el aislamiento rápido y eficiente de las miofibras del pez cebra en desarrollo. Esta metodología ha permitido el examen de las miofibras en mayor detalle que puede ser proporcionada por el análisis de embriones conjunto. La técnica se ha explotado para la caracterización de la proteína de localización subcelular 20, así como para la identificación de importantes características histopatológicas como parte de los estudios de validación en modelos de enfermedad de nuevo desarrollo 21. Además, las miofibras aisladas, además, se pueden usar para formación de imágenes en vivo y para los estudios electrofisiológicos 22, técnicas que permiten la interrogación de los aspectos clave de la función muscular. El protocolo específico para el aislamiento de miofibras, junto con dos ejemplos de experimentos analíticos posteriores, se detalla en las partes restantes de este manuscrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio de desarrollo de los músculos y la función en vivo 25,27,28. Ellos también se han convertido en un activo valioso para el modelado de enfermedades musculares humanas 14,15,20,29. Aunque se han dado grandes pasos para avanzar en el uso y aplicación de pez cebra para el estudio de la función muscular y la enfermedad del músculo, hay una necesidad crítica constante para desarrollar herramientas que perm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, y William Telfer) que contribuyeron al desarrollo de la técnica y para la producción del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Instituto Taubman, el Departamento de Pediatría de la Universidad de Michigan, y en parte de subvenciones de la Asociación de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) y los Institutos Nacionales de Salud (JJD 1K08AR054835).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 24-well culture plate | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 Independent medium | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| Collagenase Type IV | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Glass coverslips | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Pronase | Sigma | P5147 | |
| 40 μm Filter | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin antibody | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR antibody | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor antibody | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60 mm Petri dish | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Microscope slide | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| Caffeine | Sigma | C0750 |
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