قياس درجة الحموضة رغوي وعصاري خلوي<em> في فيفو</em> في تعليق خلية الخميرة
Summary
ويمكن قياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي في الخميرة الحية (<em> S. الخباز</em>) الخلايا باستخدام الأصباغ الفلورية ratiometric مترجمة إلى مقصورات الخلوية محددة. وصفنا إجراءات لقياس درجة الحموضة فجوي مع BCECF-AM، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة، ودرجة الحموضة عصاري خلوي مع ratiometric GFP حساسة للدرجة الحموضة عصاري خلوي (الخميرة pHluorin).
Abstract
فجوي ودرجة الحموضة عصاري خلوي درجة عالية من التنظيم في خلايا الخميرة، وتحتل دورا مركزيا في توازن درجة الحموضة بشكل عام. نحن تصف بروتوكولات لقياس الرقم الهيدروجيني ratiometric في الجسم الحي باستخدام درجة الحموضة حساسة fluorophores مترجمة إلى فجوة أو العصارة الخلوية. يتم قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة عندما أدخلت الخلايا في شكله استر acetoxymethyl. يتم قياس درجة الحموضة عصاري خلوي مع GFP حساسة درجة الحموضة أعرب تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة، الخميرة pHluorin. وصفت وسائل لقياس نسب مضان في تعليق خلية الخميرة في مقياس التألق. من خلال هذه البروتوكولات، وقد تم مقارنة وقت واحد نقطة قياسات الحموضة في ظل ظروف مختلفة أو في المسوخ الخميرة مختلفة، ولقد تم رصد تغيرات في درجة الحموضة على مر الزمن. كما تم تكييف هذه الأساليب إلى لوحة مضان قارئ شكل لإجراء التجارب الإنتاجية العالية. مزايا قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric أكثر من AP أخرىموصوفة أيضا مقاربات قيد الاستخدام حاليا، المشاكل المحتملة التجريبية والحلول، وآفاق استخدامها في المستقبل من هذه التقنيات.
Introduction
توازن درجة الحموضة هي عملية ديناميكية ودرجة عالية من التنظيم في جميع الكائنات الحية 1،2. العمليات البيوكيميائية وينظم بإحكام بواسطة الرقم الهيدروجيني، ويتم ضبطها البيئات داخل الخلايا إلى نطاقات ضيقة الرقم الهيدروجيني للسماح النشاط الأمثل للأنزيمات المقيمين. ومع ذلك، الخلايا التوازن درجة الحموضة يمكن الطعن من قبل التغيرات السريعة في درجة الحموضة البيئة، والتحولات الأيضية، وبعض مسارات الإشارات. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحموضة داخل الخلايا نفسها يمكن أن تكون بمثابة إشارة هامة. وأخيرا، العديد من العضيات الحفاظ على قيم درجة الحموضة lumenal التي تختلف من العصارة الخلوية المحيطة وأساسية لوظائف عضية محددة.
الخميرة خميرة الخباز أسهم عدد من آليات التوازن درجة الحموضة مع ارتفاع حقيقيات النوى 2. في العضيات الحامضية للمسار التقامي / الليزوزومية، ويتم التحكم في المقام الأول درجة الحموضة من قبل فجوي البروتون translocating أتباز حفظها للغاية (V-أتباز)، تعمل جنبا إلى جنب مع العديد من exchanالخيام تعتمد على التدرج درجة الحموضة. لديهم كل الخلايا حقيقية النواة أيضا آليات التصدير البروتون. في الفطريات والنباتات، والثانية، مضخة البروتون متميزة في غشاء البلازما، Pma1، صادرات البروتونات التمثيل الغذائي، ويعتقد أن يكون محددا رئيسيا من درجة الحموضة عصاري خلوي والمحتملة غشاء البلازما. المرونة الجينية من S. الخباز وأهميتها التجارية، جعلت من نموذج مثيرة جدا للاهتمام ومهم لدراسة توازن درجة الحموضة 2.
بالإضافة إلى كونها السبب الأساسي في عضية تحمض، وV-ATPases درجة عالية من التنظيم الانزيمات، وتهتم مختبرنا في فهم آليات التنظيم V-أتباز. وتحقيقا لهذا الهدف، لقد تم استخدام في قياس الأس الهيدروجيني pH الجسم الحي من درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي: 1) لرصد الاستجابات لتغير الظروف خارج الخلية، مثل الحرمان من الجلوكوز وreaddition، 2) لدراسة آثار الطفرات التي سطا النشاط V-أتباز، و 3) لاستكشاف COORdination من عضية والبلازما مضخات البروتون غشاء 3-5. أصبحت هذه التجارب فقط ممكن من خلال وضع مؤشرات قوية درجة الحموضة ratiometric قابلة للاستخدام في خلايا الخميرة. وأظهرت محطة وآخرون الأولى التي BCECF (2'7'-مكرر (2-carboxyethyl) -5 – (و 6)-carboxyfluorescein).، والتي تم استخدامها على نطاق واسع لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في خلايا الثدييات، يتراكم في فجوة الخميرة بدلا من العصارة الخلوية 6. ويعزى هذا الاختلاف في BCECF توطين للعديد من الإنزيمات حلمهي في فجوة، والتي من المرجح المسؤولة عن الانقسام من استر الميثيل acetoxy من BCECF-AM (استر acetoxymethyl من BCECF) والاحتفاظ فجوي 6. علي وآخرون. 7 تطويرها قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF وتكييفها هذه القياسات إلى تنسيق قارئ لوحة مضان. بريت وآخرون. عرض pHluorin الخميرة كوسيلة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في الخميرة بالإعراب عن R-المنقولة البلازميدatiometric GFP حساسة الرقم الهيدروجيني 8 تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة محددة 9.
أطياف الإثارة من كلا BCECF والخميرة pHluorin حساسة لدرجة الحموضة، بحيث يتم استخدامها كمؤشرات درجة الحموضة ratiometric فيه نسبة من مضان على اثنين من موجات الإثارة، ويقاس عند طول موجي واحد الانبعاثات، ويوفر قدرا من درجة الحموضة 8،10. وقد استخدمت هذه المجسات الخميرة درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي لكلا القياسات أحادية الخلية ومرتكزة على السكان. القياسات وحيدة الخلية 6،11 يتم تنفيذها بواسطة الفحص المجهري مضان وتحليل الصور. يتم قياس مضان فجوي أو عصاري خلوي في موجات اثنين لكل خلية. يتم تنفيذ القياسات المأخوذة من السكان في أي قارئ صفيحة ميكروسكوبية مع قدرات مضان المناسبة أو في مقياس التألق. قمنا به عموما قياسات لدينا في مقياس التألق، لأنه يوفر سهولة الوصول لإضافة مكونات مثل الجلوكوز خلال يخدعالقياسات الحركية المستمرين. يتم سرد لدينا بروتوكولات مختبر الحالية لقياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي أدناه، ويتم أيضا تكييفها بسهولة على حد سواء لفحوصات صفيحة ميكروسكوبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد استخدمت هذه البروتوكولات لمعالجة عدد من جوانب التوازن الرقم الهيدروجيني. على سبيل المثال، لدينا مقارنة الاستجابات عصاري خلوي ودرجة الحموضة من النوع البري وV-أتباز التي تعاني من نقص خلايا متحولة 4،5. لقد درست أيضا آثار تغير ظروف النمو، ودرجة الحموضة خارج الخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM50322 R01 لكين PM. الكتاب أشكر الدكتور راجيني راو، جامعة جونز هوبكنز لتوفير الخميرة البلازميدات pHluorin وللحصول على المشورة بشأن قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric، والدكتور غلوريا A. مارتينيز مونيوز على العمل بها هذه البروتوكولات لمختبرنا.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5′(and 6′)-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1′(3’H)-isobenzofuran]-3′-one and 2′,7′-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
