Medição do valor pH vacuolar e Cytosolic<em> In Vivo</em> Em Suspensions célula de levedura

Summary

PH vacuolar e citosólica pode ser medido em leveduras vivas (<em> S. cerevisiae</em>) As células utilizando corantes fluorescentes raciométrica localizadas em compartimentos celulares específicos. Nós descrevemos processos de medição de pH vacuolar com BCECF-AM, que se localiza no vacúolo em levedura e pH citosólico com uma GFP sensível ao pH raciométrica citosólica (levedura pHluorin).

Abstract

Vacuolar e pH citosólica são altamente regulamentados em células de levedura e ocupam uma papel central na homeostase do global de pH. Nós descrever protocolos de para a medição de tipo raciométrico de de pH in vivo utilizando fluoróforos-sensíveis ao pH localizadas para o o vacúolo ou citosol. De pH vacuolar é medido usando BCECF, o qual localizes para o vacúolo em levedura quando introduzido em células de, na sua forma éster de acetoximetilo. De pH Cytosolic é medido com um a GFP de pH-sensível expressou ao abrigo o controle de um promotor de levedura, de levedura pHluorin. Métodos para a medição de dos rácios de de fluorescência em suspensões de celulares de leveduras em um fluorímetro são descritos. Através de estes protocolos, as medições de pontos tempo de solteiro de de pH ao abrigo condições diferentes ou em diferentes mutantes de de levedura tenham sido comparados e mudanças no pH ao longo do tempo tenham sido monitorizados. Esses métodos também tiverem sido adaptadas ao um formato de leitor de placas de a fluorescência para a experimentos high-throughput. Vantagens de medições de pH raciométrica mais de outro apdagens atualmente em uso, potenciais problemas de e soluções experimentais, e prospects para uso futuro de estas técnicas também são descritas.

Introduction

a homeostase de pH é uma processo dinâmico e altamente regulamentado em todos os organismos ^1,2. Processos bioquímicos são rigidamente regulada pelo pH, e ambientes de intracelulares estão sintonizados para gamas de pH estreitas para permitir que uma actividade óptima de as enzimas de residentes. No entanto, a homeostase pH intracelular pode ser desafiado por mudanças rápidas na pH ambiental, turnos de metabólicas, e de certas vias de sinalização. Além disso, o pH de intracellular pode em si mesmo servir como um sinal importante. Finalmente, muitas organelas manter os valores de de pH lumenal que são distintas a partir de o citosol circundante e essencial para as funções específicas-organela.

Os de levedura de Saccharomyces partes cerevisiae um certo número de mecanismos de da homeostase de pH com a eucariotas superiores ^2. In as organelas ácidas de o pathway endocytic / lysosomal, pH é controlado, principalmente, pela altamente conservada vacuolar ATPase próton-translocating (V-ATPase), atuando em tandem com muitos exchaniurtas dependentes relativa à gradiente de pH. Todos os células eucarióticas também têm mecanismos de exportação de prótons. In é acreditado fungos e plantas, uma segunda da bomba de próton, distinto na membrana plasma, Pma1, as exportações prótons metabólicas e para ser o dos principais determinantes da pH citosólica e potencial de membrana plasma. A flexibilidade genética de S. cerevisiae e sua importância comercial, fizeram-lhe um modelo de muito interessante e importante para o estudo de a homeostase pH ^2.

In Além de ser os drivers de primárias de organelle a acidificação, V-ATPases são altamente regulamentados enzimas e nosso laboratório de está interessado em compreender mecanismos de regulação V-ATPase. Rumo a este objetivo, temos vindo a utilizar em medições de pH in vivo de pH vacuolar e citosólica: 1) para monitorar respostas aos mudanças nas condições de extracelulares, tais como privação glicose e readdition, 2 de) para examinar os efeitos de mutações que compromisso de atividade V-ATPase, e 3) para explorar a coordenação de organelle e plasma de membrana bombas de protões ^3-5. Estes experimentos só se tornou possível através de o desenvolvimento de robustas indicadores de pH raciométrica passíveis da para usar em células de levedura. . Vegetal et ai mostrou pela primeira vez de que BCECF (2'7'-Bis-(2-carboxietilo) -5 – (e 6 de)-carboxif luoresceina), o qual tem sido utilizado amplamente para medir o pH citosólica em células de mamíferos, se acumula em o vacúolo de levedura em vez de o citosol ^6. Esta diferença na BCECF localisation tem sido atribuída a as muitas enzimas hidrolíticas em o vacúolo, os quais são provável responsável pela clivagem do o éster de meti Io acetoxi a partir de BCECF-Rádio AM (éster acetoximetilo de BCECF) e retenção de vacuolar ^6. Ali et ai. ⁷ ainda mais desenvolvido pela medição do pH vacuolar usando BCECF e adaptado estas medições para um formato de leitor de placas de de fluorescência. De Brett et ai. Apresentar-pHluorin de levedura como um meio de de medição de pH citosólica em levedura por expressar os um r r plasmídeo de-borneatiometric a GFP de pH-sensível ^8, sob controlo de um promotor específico-levedura ^9.

O Os espectros de de excitação de tanto BCECF e levedura de cerveja pHluorin são sensíveis-se até pH, assim, elas são usados ​​como indicadores de pH raciométrica na qual o rácio de de de fluorescência a dois comprimentos de onda de excitação, medidos em condições um único comprimento de onda de emissão de, e que providencia uma medida de de pH ^8,10. Estes sensores de pH vacuolares e citosólica levedura têm sido utilizados para ambas as medições single-cell and-baseada em população. Medições de-de células Um único ^6,11 são executadas por microscopia de de fluorescência e de análise de imagem. De fluorescência vacuolar ou citosólica aqui as dois comprimentos de onda é medido para as cada célula. As medições-baseados em população são efectuado tanto na um leitor de microplacas de com capacidades de de fluorescência adequadas ou o em um f luorimetro. Nós têm, em geral feito os nossos de medições sobre uma fluorímetro, com um porque ele fornece do fácil acesso para adição de componentes, tais como glucose durante engodomedições de cinéticos contínuo. Nossos protocolos de actuais do laboratório para a medição de de de pH vacuolar e citosólica são coletados abaixo; ambos também são facilmente adaptados-se a ensaios de microplacas.

Protocol

1. Medição do valor pH vacuolar Em a Vivo Usando BCECF-Rádio AM Cresça um de 50 ml de cultura líquido de o estirpe de levedura para ser medido em a médio o desejar o pernoite. A meta é para têm células de em fase de meados-de log (DO600 (densidade óptica a 600 de nm) à mensuração dos aproximadamente, de 0,8 para a suspensão). Da pelota as células de levedura, por centrifugação em. Ressuspender o o pellet em 0,6 ml de o meio de crescimento e transferência para um tubo de mi…

Representative Results

A Figura 1 apresenta os dados de pH vacuolar obtidos em células de levedura de tipo selvagem cultivadas em meio rico (extracto de levedura-peptona-dextrano; YEPD), tamponadas a pH 5 com 50 mM de MES. Frequentemente crescer as células em meio tamponado, porque o pH do meio pode mudar dramaticamente durante o crescimento durante a noite, em especial para um meio mínimo, e verificou-se que o pH do meio de crescimento pode afectar as respostas do pH vacuolar 3. No entanto, também é aceitáve…

Discussion

Nós utilizamos esses protocolos para abordar uma série de aspectos da homeostase do pH. Por exemplo, nós compararam respostas citosólicas e pH de células mutantes do tipo selvagem e V-ATPase deficiente ^4,5. Examinamos, também, os efeitos das condições de crescimento alterados, pH particularmente extracelular, em resposta pH vacuolar de glicose ^3. É importante ressaltar que as respostas que observamos são consistentes com outros métodos de medição de pH quantitativa e com dados bioquím…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250