Vakuolar ve sitosolik pH Ölçümü<em> In Vivo</em> Maya hücre süspansiyonlarında
Summary
Vakuolar ve sitozolik pH canlı maya ölçülebilir (<em> S. cerevisiae</em>) Özel hücre bölmeleri lokalize rasyometrik floresan boyalar kullanarak hücreleri. Biz maya vakuol için lokalize BCECF-AM, ve bir sitozolik rasyometrik pH duyarlı GFP (maya pHluorin) ile sitozolik pH ile vakuolar pH ölçümü için prosedürler tarif.
Abstract
Vakuolar ve pH sitozolik yüksek maya hücreleri düzenlenmiştir ve genel pH dengesini merkezi bir rol işgal edilir. Biz vakuol veya sitoplazmada lokalize pH duyarlı fluorophores kullanarak in vivo pH oranlı metrik ölçümü için protokolleri tarif. Vakuolar pH onun asetoksimetil ester halinde hücreler içine dahil edildikleri zaman, maya vakuol lokalize BCECF ile ölçülmektedir. Sitosolik pH değeri, bir maya promotör, maya pHluorin kontrolü altında ifade edilen, pH'ye duyarlı, GFP ile ölçülür. Bir fluorimetre maya hücre süspansiyonlarında floresan oranları ölçümü için yöntemler tarif edilmiştir. Bu protokollerin sayesinde, farklı koşullar altında ya da farklı maya mutant pH tek bir zaman noktasında ölçümleri karşılaştırılmıştır ve zaman içinde pH değişiklikleri takip edilmiştir. Bu yöntemler aynı zamanda yüksek hacimli deneyler için flöresanlı bir plaka okuyucu biçimine uyarlanmıştır. Diğer ap üzerinde rasyometrik pH ölçümleri Avantajlarışu anda kullanılan, olası deneysel sorunlar ve çözümleri ve bu tekniklerin ileride kullanmak için umutları izlenen yolun da açıklanmıştır.
Introduction
pH dengesini bütün organizmalar 1,2 dinamik ve oldukça düzenli bir süreçtir. Biyokimyasal süreçlerin sıkı pH tarafından düzenlenir ve hücre içi ortamlarda ikamet enzimlerin en iyi etkinlik sağlamak için dar pH aralıkları için ayarlanmıştır. Ancak, hücre içi pH dengesini çevre pH, metabolik değişimler ve bazı sinyal yolları hızlı değişiklikler itiraz edilebilir. Buna ek olarak, hücre içi pH önemli bir sinyal olarak kendini hizmet edebilir. Son olarak, birçok organeller organel-özel işlevler için çevredeki sitoplazmada farklı ve gerekli olan lumenal pH değerlerini korumak.
Yüksek ökaryotlar 2 ile pH dengesini mekanizmaların maya Saccharomyces cerevisiae hisse bir dizi. Lizozomal / endositik yolunun asidik organeller olarak, pH öncelikle birçok exchan ile birlikte hareket eden, son derece korunmuş vakuolar proton-translocating ATPaz (V-ATPaz) tarafından kontrol edilirpH degrade bağlıdır Gers. Tüm ökaryotik hücreler aynı zamanda proton verme mekanizması vardır. Olarak mantar ve bitkiler, plazma zarı ikinci bir, ayrı proton pompa, Pma1, ihracat metabolik proton ve sitozolik pH ve plazma membran potansiyeli en önemli belirleyici olduğuna inanılıyor. S. genetik esnekliği cerevisiae ve ticari önemi, bu pH dengesini 2 eğitim için çok ilginç ve önemli bir model yaptık.
Organel asitlenme birincil sürücüleri olmasının yanı sıra, V-ATPaz yüksek enzimler düzenlenir ve laboratuvar V-ATPaz düzenleme mekanizmaları anlamak ilgileniyor. Bu hedefe doğru, biz vakuolar ve sitozolik pH in vivo pH ölçümlerinde kullanıyorum: 1) mutasyonların etkilerini bu uzlaşma V-ATPaz aktivitesini incelemek için glikoz yoksunluk ve readdition, 2 olarak değişen hücre dışı koşullar,) yanıtları izlemek için, ve 3) koordine keşfetmek içinorganel ve plazma membran proton pompa 3-5 koordi-nasyonunu sağlıyor. Bu deneyler sadece maya hücreleri kullanmak için uygun sağlam rasyometrik pH göstergelerin geliştirilmesi yoluyla mümkün oldu. . Memeli hücrelerinde sitosolik pH'ını ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır,, maya vakuol birikir – Bitki ve ark olanlar BCECF ((ve 6)-karboksifloresan 2'7'-Bis-(2-karboksietil) -5) gösterdi yerine sitoplazmada 6. BCECF lokalizasyon bu fark BCECF-AM (BCECF arasında asetoksimetil ester) ve vaküler tutma 6 asetoksi metil esterin parçalanması için olası sorumludur vakuol birçok hidrolitik enzimler, atfedilmiştir. Ali ve diğ. 7 daha BCECF kullanılarak vakuolar pH ölçümü geliştirilen ve bir floresan plaka okuyucu biçimi için bu ölçümler uyarlanmıştır. Brett ve ark. Bir plazmid kaynaklı R ifade ederek maya sitosolik pH ölçümü için bir araç olarak maya pHluorin tanıtılanBir mantar-spesifik promotör 9 arasında kontrol altında atiometric pH duyarlı GFP 8.
BCECF ve maya pHluorin iki uyarma spektrumları pH'a duyarlıdır, bu nedenle tek bir emisyon dalga boyunda ölçülen iki uyarma dalga boyu, önceki floresans oranı pH 8,10 arasında bir ölçü sağlar ki rasyometrik pH göstergesi olarak kullanılır. Bu maya vakuolar ve sitozolik pH sensörleri hem tek hücreli ve toplum temelli ölçümler için kullanılmaktadır. Tek hücreli ölçümleri 6,11 floresan mikroskopi ve görüntü analizi ile gerçekleştirilir. Iki dalga boyunda Vakuolar veya hücre floresan her bir hücre için ölçülür. Popülasyon tabanlı ölçümleri uygun floresan özelliklerine sahip bir mikroplaka okuyucu ya da ya da bir fluorimetre gerçekleştirilir. Bu con sırasında glikoz gibi bileşenlerin yanı sıra kolay erişim sağlar çünkü genellikle, bir florimetresi bizim ölçümleri yapmışmanın hikayesi kinetik ölçümleri. Vakuolar ve sitosolik pH değerinin ölçümü için mevcut laboratuar protokoller aşağıda belirtilmiştir; hem de kolayca mikroplaka deneyleri için uyarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz pH dengesinin yönlerini bir dizi adrese bu protokolleri kullanmış olurlar. Örneğin, 4,5-yabani tip ve V-ATPaz eksikliği mutant hücreler sitozolik pH ve yanıtlar bakımından karşılaştırdık. Ayrıca glikoz 3 vakuolar pH yanıt değişmiş büyüme koşulları, özellikle hücre dışı pH, etkilerini inceledik. Önemlisi, biz gözlemlemek tepkiler hem nicel pH ölçümü diğer yöntemlerle ve proton pompa değişmiş faaliyetleri anlatan biyokimyasal verilerle uyumludur.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma PM Kane için NIH R01 GM50322 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bizim laboratuar için bu protokollerin çalışma dışarı Dr Rajini Rao, maya pHluorin plazmid sağlamak için ve rasyometrik pH ölçümleri tavsiye için Johns Hopkins Üniversitesi ve Dr Gloria A. Martinez Munoz teşekkür ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
References
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5′(and 6′)-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1′(3’H)-isobenzofuran]-3′-one and 2′,7′-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
