단백질의 지역화 및 배포는 세포 기능을 이해하기위한 중요한 정보를 제공합니다. 전자 현미경의 우수한 공간 해상도 (EM)는 주어진 항원에 따라 immunohistochemistry의 subcellular 지방화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 유지 항원은 EM 연구에 특히 곤란했던 반면 구조적 무결성을 유지 중추 신경계 (CNS)의 조직하십시오. 여기, 우리는 공부를 할 수있는 CNS에 구조와 항원을 보존하고 쥐 hippocampal CA1 피라미드 뉴런에서 시냅스 단백질을 특성화하는 데 사용 된 절차를 채택한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Immunoelectron 현미경은 subcellular 수준에서 생물 분자를 연구 할 수있는 강력한 도구입니다. 이러한 콜로이드 금과 같은 전자 - 고밀도 마커에 연결된 항체가 다양한 조직 1 특정 항원의 지역화 및 배포를 공개 할 수 있습니다. 두 가장 널리 사용되는 기법은 사전 삽입 및 사후 삽입 기술이다. 사전 퍼가기 immunogold - 전자 현미경 (EM) 기술에서, 조직은이 내장되기 전에 항체 침투를 허용하도록 permeabilized해야합니다. 이 기술은 구조이지만 항체의 가난한 침투는 (보통은 처음 몇 ㎛) 상당한 단점 2를 보존 이상적입니다. 항원이 더 쉽게 접근 할 수있는 곳 라벨이 고정 조직의 섹션에서 진행하기 때문에 사후 퍼가기 라벨 방법이 문제를 피할 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 수정 번호 immunoreactivity을 강화하고 ultrastructure을 유지하기 후 삽입 방법을 향상 조직 고정은 EM 연구의 중요한 부분입니다. Fixatives는 화학적 곳에서 조직 구조를 잠글 고분자를 crosslink. 정착액의 선택은 구조 보존뿐만 아니라 항원 및 대비뿐만 아니라 영향을 미칩니다. 오스뮴의 tetroxide (OSO 4), 포름 알데히드, 그리고 글 루타 알데히드는 중추 신경계 (CNS) 화학 및 물리적 처리 중 구조적인 손상에 특히 경향이 조직에 포함 수십 년 동안 표준 fixatives했습니다. 불행하게도, OSO 4 반응성이 매우 높은이며, 가난하고 부족한 라벨의 결과로, 항원에게 6 숨길 수 표시되었습니다. 화학 고정을 피하기 위해 다른 접근 방법은 조직을 동결 있습니다. 하지만이 기술은 고가의 계측을 수행하고 필요로하기가 어렵습니다. 이러한 문제 중 일부를 해결하려면 및 CNS의 조직 라벨, Phend 외를 향상시킬 수 있도록 지원합니다. uranyl 아세트산 (UA)과 타닌 성의 ACI와 OSO 4 교체D (TA), 그리고 성공적으로 항원 검출 및 뇌 및 척수의 조직 7 구조 보존의 감도를 향상시키기 위해 추가 수정을 소개했다. 우리는 쥐의 뇌 조직이 오스뮴 무료 후 퍼가기 방법을 채택하고 신경 단백질을 감지하고 공부하기 immunogold 라벨 기술을 최적화했습니다.
우리는 여기서 쥐 hippocampal CA1 피라미드 뉴런의 시냅스 단백질의 ultrastructural 현지화를 결정하는 방법을 제시한다. 우리는 organotypic hippocampal 조각 양식을 사용합니다. 이 조각은 해마의 trisynaptic 회로를 유지하고, 따라서이 신경 소성을 공부에 특히 유용합니다, 메커니즘이 널리 학습과 기억을 기초 생각. 출생 후의 일 5와 6 마우스 / 쥐 새끼에서 Organotypic hippocampal 슬라이스는 이전에 8에 설명 된대로 준비하고, 심하게 분해 또는 overexpress 외인성 단백질에 특히 유용합니다 수 있습니다. 우리는 이전에 채널이 프로토콜을 사용했습니다neurogranin (잉), 신경 기능 할 8,9을 조절에 중요한 역할이있는 뉴런 특정 단백질을 aracterize. 우리는 또한 calmodulin (CAM) 및 CA 2 + / CAM에 의존 단백질 키나제 II (CaMKII) 10의 ultrastructural 현지화를 특징하는 데 사용했습니다. 결과에 도시 된 바와 같이,이 프로토콜은 수지상 쪽과 척추 8의 분포를 특성화하는 데 도움이 잉 효율적으로 라벨을 잘 ultrastructural 보존 할 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 절차는 neuronal 기능에 관여 다른 많은 단백질을 연구에 다양한 응용을 할 수 있습니다.
프로토콜
1. 정착
Fixatives는 발암 성이다; 장갑을 착용하고 연기 후드에 fixatives를 처리합니다. 별도로 명시하지 않는 한, 모든 incubations은 얼음에 완료하고 모든 솔루션은 사용하기 전에 필터링해야합니다. 전자 현미경 수준의 시약을 사용합니다.
1 일
- 실험 조건 후 (예 : 바이러스 주입, 약물 치료)에 organotypic hippocampal 슬라이스로 막 배치 60 X 얼음처럼 차가운 0.1 M 인산 버퍼 (소렌슨의 인산 완충), pH를 7.3를 포함하는 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시. 1 추가 - 직접 조각 위에 0.1 M 인산 버퍼 2 ML 그들에게 차가운 유지할 수 있습니다.
임계 단계 : 항상 신선하게 조리 된 버퍼와 fixatives을 사용합니다. 버퍼의 pH가 원하는 범위 내에 있는지 확인하십시오. 그렇게 할 실패 세포 구조를 손상 수 있습니다.
- 슬라이스의 CA1의 subfield를 분리하려면,를 사용하여부드럽게 CA1 세포 레이어
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 2B는 CA1 hippocampal 피라미드 뉴런의 수지상 쪽의 내생 잉 분자의 분포의 예를 보여줍니다. 해마의 CA1 영역을 (그림 2A에서 본)이 포함 된 ultrathin (60 나노 미터) 조직과 니켈 격자은 1 %에 덮여 된 후 반으로 부화하기 전에 2.5 % BSA와 혈청 2.5 %로 차단 T / PB, 50 MM 글리신, - 잉 항체. T / PB와 함께 세탁하면, 격자는 이후 10 나노 미터의 금으로 커플 링 방지 토끼 차 항체로 덮여 있었다. 마지막으로, 격자는 T / PB와 세척 및 2 % uranyl 아세테이트와 대비를 강화하기 위해 얼룩 레이놀즈 리드 구연산에 이어 2 % 글 루타 알데히드와 postfixed되었습니다. 비대칭 시냅스를 보여주는 왼쪽, 대표 전자 micrographs이 있습니다. postsynaptic 구획의 식별은 전자 집적 PSD (화살표 머리)와 잘 정의 된 플라즈마 막에 의해 촉진되는 것은. 맞.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜에서는, 우리는 쥐 hippocampal 슬라이스 문화의 수지상 쪽을 연구하는 뇌와 척추의 조직에 대한 Phend와 와인버그 방법을 채택했다. hippocampal CA3-CA1 지역의 수지상 쪽은 neuronal 기능을 조절에 중요한 역할을 단백질의 광대 한 다양한을 포함하는 섬세한 구조입니다. 제시 방법은 적절한 라벨 효율성과 척추 내 특정 항원의 분포를 특성화하는 데 유용합니다 좋은 재현성을 허용, 좋은 ultrastructural 보존 (그림 2A)을 유지하면서 향상된 항원을 달성하기위한 균형 잡힌 접근 방식을 제공합니다. 여기, 우리는 10 나노 콜로이드 금으로 응 표시. 우리는 시냅스 기능 (그림 2B) 8 년에 역할을 이해하는 데 도움 잉의 라벨 패턴을 생성하기 위해 금을 정량화.
immunogold의 정량 분석 방법 11-13의 다양한 수행 할 수 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.
감사의 글
저자는 hippocampal 슬라이스 문화의 준비를 위해 매튜 피렌체 감사드립니다. 이 작품은 미국 국립 노화에 연구소 NZG에 알츠하이머 협회에서 교부금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 60 x 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시 | Falcon | 351007 | |
| 일회용 메스 | EXELINT | 29552 | |
| 세포 배양 인서트 | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm 염소 - 안티 토끼 골드 | 전자 현미경 과학 | 25108 | |
| 안티 뉴로 그라닌 항체 | Millipore | AB5620 | |
| 100% 피크르산 | 전자 현미경 과학 | 19550 | |
| 96% 파라포름알데히드 | 아크로스 유기물 | AC41678-0030 | |
| 25% 글루타르알데히드(EM 등급) | Sigma | G5882 | |
| 우라닐 아세테이트 | 전자 현미경 과학 | 22400 | |
| p-페닐렌디아민 | 시그마 | P6001 | |
| 플래티넘(IV) 클로라이드 | Sigma | 379840 | |
| 탄닌산 | 전자 현미경 과학 | 21710 |
참고문헌
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. His....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
