Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Summary

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Abstract

O uso de cardiomiócitos primários (CMS), em cultura tem proporcionado um complemento poderoso para modelos murinos de doenças do coração em avançar na compreensão de doenças do coração. Em particular, a possibilidade de estudar a homeostase de íons, função canal iônico, excitabilidade celular e acoplamento excitação-contração e suas alterações em condições de doentes e por mutações causadoras de doenças levaram a insights significativos sobre doenças cardíacas. Além disso, a falta de uma linha de células adequada imortalizado para imitar adulto CMs, e as limitações dos CMs neonatal (que não têm muitos da característica biomecânica estrutural e funcional do adulto CMs) na cultura têm dificultado a compreensão da complexa interação entre as vias de sinalização, canais iônicos e propriedades contráteis no coração adulto reforçando a importância do estudo adultos cardiomiócitos isolados. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento, a cultura, a manipulação da expressão gênica por adenovírus-expreproteínas sseD, e posterior análise funcional dos cardiomiócitos do rato adulto. O uso destas técnicas irá ajudar a desenvolver uma visão mecanicista em vias de sinalização que regulam a excitabilidade celular, Ca ^{2 +} dinâmica e contratilidade e fornecer uma caracterização muito mais fisiologicamente relevante de doença cardiovascular.

Introduction

Modelos murinos de doenças cardiovasculares têm servido como ferramentas eficazes para elucidar os mecanismos fundamentais de doença ^1,2, bem como para identificar potenciais alvos terapêuticos ^1,3. Em particular, o uso de ambos os modelos de murino de doença cardíaca adquirida (tais como sobrecarga de volume) ^4,5 e modelos de ratinhos transgénicos têm avanços na compreensão da doença cardíaca ^6-8. A utilização de técnicas de cultura celular para estudar cascatas de sinalização ^3,9,10 e alterações em proteínas individuais que estão subjacentes a excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção no coração ^11-13 ao nível de uma única célula foram complementados os modelos in vivo de ratinho. No entanto, a falta de linhas celulares adequadas que reflectem a estrutura e função de adulto CM tem sido uma limitação significativa. Os investigadores têm tentado ultrapassar esta estudando proteínas individuais, tais como a canais de iões, em sistemas de expressão heterólogos <sup> 14, e, embora estes estudos nos forneceu informações úteis em termos de biofísica canais iônicos ou tráfico de proteína, a representação inadequada do microambiente nativo de CMs é uma limitação significativa. Em segundo lugar, já que a maioria dessas células heterólogas não tem um aparelho contrátil maduro, não foi possível estudar a função contrátil e da complexa interação entre excitabilidade celular e contração. Por esse motivo, os investigadores voltaram-se para as culturas de células cardíacas primárias para muitos dos seus estudos funcionais in vitro. Finalmente, os estudos de cardiomiócitos isolados permitir a avaliação da função contrátil, sem os fatores de confusão de preparação multicelular, incluindo o efeito de cicatriz ou fibrose e orientação das fibras.

Cardiomiócitos ventriculares de rato neonatal primárias (NRVMs) são relativamente fáceis de cultura, podem ser infectadas com adenovirus e lentivírus para manipular a expressão do gene ^15, umaª Assim, foram utilizadas com sucesso ^1, mas têm limitações próprias. Embora eles fornecem um microambiente fisiológico ¹ e tem sido o carro-chefe do campo de sinalização, diferenças substanciais entre a morfologia ea organização subcelular de NRVMs e cardiomyoctyes adultos torná-los um modelo inadequado para a investigação de fluxos iônicos e acoplamento excitação-contração no coração de adultos . Mais notavelmente NRVMs falta uma t-tubular subsistema definitiva ^4. Desde Ca ^{2 +} fluxo e dinâmica é criticamente dependente maduro t-tubular e retículo sarcoplasmático (RS) estrutura ^6, Ca ^{2 +} dinâmica e estudos funcionais da contratilidade cardíaca em NRVMs não são um reflexo preciso desses processos críticos em cardiomiócitos adultos. Além disso, alguns componentes de vias de sinalização diferente entre ratos neonatal e adulto ^9, proporcionando assim uma outra limitação para o estudo de processos de doença e sua icompactas na excitabilidade celular e contratilidade em NRVMs. Finalmente, a distribuição da máquina contrátil leva ao encurtamento célula multidireccional e não uniforme, limitando a precisão das medições contrácteis.

O uso de cardiomiócitos adultos isolados fornece, portanto, um sistema in vitro de modelagem mais precisa. O crescimento extraordinário do conhecimento tornada possível pela manipulação genética de ratinhos sublinha a importância da obtenção funcionais cardiomiócitos isolados a partir de murganhos. Na verdade, a caracterização dos CMs adultas isoladas de modelos de mouse lançou luz sobre muitos eventos biológicos e patológicos. CMs isoladas a partir de modelos de camundongos transgênicos têm permitido estudos sobre o ganho ou perda de função das proteínas nas propriedades contráteis de células individuais ^2,16, e viabilidade em modelos de doenças, como a isquemia / reperfusão ^17,18, complementando, assim, informações obtidas a partir de estudos in vivo sobre oratinhos SE. Uso de isolado adulto CMs de modelos murinos de doença cardíaca adquirida ^3,19,20 (como sobrecarga de pressão induzida pela constrição da aorta transversa, que a hipertensão imita ou estenose da válvula aórtica) ou exercício ^5,21 (para a modelagem de hipertrofia fisiológica) permite a análise da interacção de cascatas de sinalização envolvidos nestes processos com excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção ao nível de uma única célula. Além disso, a capacidade de manipular a expressão de genes usando a expressão do gene dirigido adenoviral no adulto CMs nos oferece a oportunidade para dissecar os componentes de vias de sinalização complexas.

Do ponto de vista eletrofisiológico, a tensão de célula inteira e experiências atuais sobre grampo isolado adulto CMs foram fundamentais para elucidar a natureza dos fluxos iônicos no início do estudo e em vários estados de doença. Devido à estrutura complexa da membrana celular e a prote diferencialem estruturas de andaimes adulto entre as linhas de células heterólogas CMs e NRVMs ou, a capacidade de corrigir células adultas dá um muito melhor representação dos efeitos de certas proteínas de membrana, proteínas estruturais, e os parceiros de canais iónicos que interagem nos componentes electrofisiológicas do coração de adulto.

Apesar de tais vantagens proeminentes no estudo adultos cardiomiócitos murinos, isolar e cultivar cardiomiócitos ratos adultos tem sido um desafio, pedindo que a necessidade de uma descrição sistemática e precisa da metodologia para isolar cardiomiócitos viáveis ​​do mouse e mantê-los na cultura para permitir ainda mais a manipulação genética usando viral vetores. Estudos anteriores já haviam usado tanto agudamente isolado do rato adulto CMs ou culta rato adulto CMs. Estes últimos são mais fáceis de cultura de rato adulto CMs, ea maioria dos experimentos manipulando expressão gênica in vitro têm usado rato adulto CMs. Poucos estudos têm alterado e investigados functi com sucessoa expressão do gene onal em rato adulto CMs, apresentando uma grande limitação no âmbito de experiências. Portanto, aqui apresentamos detalhadamente tais metodologias, modificado a partir de investigações anteriores, para o isolamento ^7,8,22, cultura ^3,10,15,23, infecção adenovírus ^11-13,15, e análise funcional de cardiomyoctyes ventriculares adulto do rato. Este protocolo resulta em isolamento Ca ^{2 +-tolerantes,} cardiomiócitos excitáveis ​​que temos com sucesso cultivadas por até 72 horas e transitoriamente transfectadas com adenovírus. A funcionalidade destas células isoladas pode ser avaliada utilizando o sistema de imagem MMSYS ^14,24 e patch-clamp, que também será discutida.

Protocol

1. Cardiomyocyte Isolamento Materiais (Figura 1) Microdissecting fórceps Uma pinça Pinça hemostática delicados Pinça hemostática Microdissecting, serrilhados, fórceps curvos Tesoura operacionais, em linha reta Tesoura Operacionais, curvo Tubos de 15 ml Falcon (5) 60 milímetros placa de Petri Tampão fosfato (PBS) Nylon Mesh – tamanho 400 mM poros Pequeno funil <br …

Representative Results

O isolamento dos adultos cardiomyoctyes resultados em células em forma de bastonete, estriados, e quiescentes (não bater espontaneamente) (Figura 5A). As células mortas vão olhar arredondado e sem estrias estarão presentes. As células quiescentes podem ser cultivadas e transfectadas com o adenovírus para manipular a expressão do gene (Figuras 5B e 5C). Após 24 horas de cultura, a morfologia das células vivas não muda, elas ainda são Ca2 +-tolerante,</su…

Discussion

Neste relatório, nós descrevemos as técnicas necessárias para o isolamento do sucesso e da cultura do adulto CMs do coração mouse. A nossa técnica permite o estudo subsequente da função LV e excitabilidade utilizando os métodos descritos acima. O parâmetro fundamental para o estudo da funcionalidade do adulto CMs é a saúde ea qualidade do CMs isoladas. Como descrito acima, as nossas técnicas de permitir um elevado rendimento de células funcionais que são susceptíveis a manipulação da expressão de gen…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907