Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes
Summary
Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.
Abstract
Het gebruik van primaire cardiomyocyten (CMS) in cultuur heeft een krachtige aanvulling verstrekt aan muismodellen van hart-en vaatziekten in het bevorderen van ons begrip van hart-en vaatziekten. Met name de mogelijkheid om ion homeostase, ionenkanalen, cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling en hun veranderingen te bestuderen in zieke omstandigheden en ziekteverwekkende mutaties geleid tot aanzienlijke inzichten hartziekten. Bovendien zijn het ontbreken van een adequate vereeuwigd cellijn te bootsen volwassen CM's, en de beperkingen van neonatale CM's (die veel van de structurele en functionele biomechanica kenmerk van volwassen CM missen) in de cultuur van ons begrip van de complexe wisselwerking tussen signaalwegen belemmerd, ionkanalen en contractiele eigenschappen in het volwassen hart versterken het belang van het bestuderen van geïsoleerde hartspiercellen volwassene. Hier presenteren we methoden voor de isolatie, cultuur, manipulatie van genexpressie door adenovirale-expressed eiwitten en daaropvolgende functionele analyse van cardiomyocyten van volwassen muis. Het gebruik van deze technieken zullen helpen mechanistisch inzicht ontwikkelen tot signaalwegen die cellulaire exciteerbaarheid reguleren, Ca2 + dynamiek en contractiliteit en een veel fysiologisch relevante karakterisering van cardiovasculaire ziekte.
Introduction
Muismodellen van cardiovasculaire ziekte hebben gediend als doeltreffende instrumenten voor het ophelderen fundamentele ziektemechanismen 1,2 en voor het identificeren van potentiële therapeutische targets 1,3. Met name het gebruik van beide muizenmodellen van verworven hartziekte (zoals druk-overbelasting) 4,5 en transgene muismodellen hebben ons begrip van hartkwaal 6-8. Het gebruik van celkweek technieken signalering cascades 3,9,10 en veranderingen te bestuderen in individuele eiwitten die cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling grondslag liggen in het hart 11-13 op het niveau van de cel zijn een aanvulling op de in vivo muismodellen. Echter, het gebrek aan adequate cellijnen die volwassen CM structuur en functie weerspiegelen een belangrijke beperking geweest. Onderzoekers hebben geprobeerd om dit te overwinnen door het bestuderen van afzonderlijke eiwitten, zoals ionenkanalen, in heterologe expressiesystemen <sup> 14, en terwijl deze studies hebben ons voorzien van nuttige informatie in termen van ionkanaal biofysica of eiwit mensenhandel, onvoldoende vertegenwoordiging van de inheemse micromilieu van CMS is een belangrijke beperking. Ten tweede, aangezien de meeste van deze heterologe cellen een volwassen contractiele apparaat niet, maar het is onmogelijk geweest om contractiele functie en de complexe wisselwerking tussen cellulaire exciteerbaarheid en contractie te bestuderen. Daarom hebben onderzoekers zich tot primaire cardiale celkweken voor veel van hun in vitro functionele studies. Tot slot, geïsoleerde cardiomyocyte studies beoordeling van contractiele functie mogelijk te maken zonder de verstorende factoren van meercellige voorbereiding inclusief het effect van litteken of fibrose en vezeloriëntatie.
Primaire neonatale rat ventriculaire cardiomyocyten (NRVMs) zijn relatief gemakkelijk te kweken, kunnen worden besmet met adenovirussen en lentiviruses genexpressie 15 te manipuleren, eennd zijn daarom succesvol 1 gebruikt, maar hebben beperkingen eigen. Hoewel ze een fysiologische micro 1 en het werkpaard van het veld signalering zijn aanzienlijke verschillen tussen de morfologie en subcellulaire ordening NRVMs en volwassen cardiomyoctyes ze onvoldoende model voor het onderzoek van ionische stromen en excitatie-contractie koppeling in het volwassen hart . Met name NRVMs ontbreekt een definitief t-buisvormige subsysteem 4. Sinds Ca 2 + flux en dynamiek zijn sterk afhankelijk van volwassen t-buis-en sarcoplasmatisch reticulum (SR) structuur 6, Ca 2 + dynamiek en functionele studies van de cardiale contractiliteit in NRVMs zijn geen weerspiegeling van deze kritische processen bij volwassen hartspiercellen. Verder is een aantal onderdelen van signaalwegen verschillen tussen neonatale en volwassen muizen 9, waardoor andere beperking voor het bestuderen van de ziekte processen en hun impact op cellulaire prikkelbaarheid en contractiliteit in NRVMs. Tenslotte, de verdeling van de contractiele machinerie tot multidirectionele en niet-uniforme cel verkorting van de juistheid van de contractiele metingen beperken.
Het gebruik van geïsoleerde volwassen hartspiercellen geeft daarom een nauwkeuriger in vitro modelsysteem. De buitengewone groei van kennis mogelijk gemaakt door de genetische manipulatie van muizen onderstreept het belang van het verkrijgen van functionele geïsoleerde cardiomyocyten van muizen. In feite heeft de karakterisering van volwassen CM's geïsoleerd van muismodellen licht werpen op vele biologische en pathologische gebeurtenissen. Geïsoleerd CMs van transgene muismodellen hebben toegestaan voor studies van de winst of het verlies van de functie van eiwitten op de contractiele eigenschappen van enkele cellen 2,16, en de leefbaarheid in de ziekte van modellen zoals ischemie / reperfusie 17,18, waardoor informatie uit in aanvulling vivo studies over dese muizen. Het gebruik van geïsoleerde volwassen CM's van muismodellen van verworven hartziekten 3,19,20 (zoals dwarse aorta-vernauwing veroorzaakte druk overbelasting, dat nabootst hypertensie of aortaklepstenose) of de uitoefening 5,21 (voor het modelleren van fysiologische hypertrofie) maakt voor het onderzoek van de interactie van signalerende cascades betrokken bij deze processen cellulaire exciteerbaarheid en excitatie-contractie koppeling op het niveau van de cel. Bovendien is de mogelijkheid om genexpressie te manipuleren met behulp van adenovirale aangedreven genexpressie in volwassen CM biedt ons de mogelijkheid om de componenten van complexe signalerende wegen ontleden.
Vanuit een elektrofysiologisch perspectief hebben whole-cell spanning en stroom clamp experimenten op geïsoleerde volwassen CMs kritisch geweest in het ophelderen van de aard van de ionische stromen bij aanvang en bij diverse ziektebeelden. Vanwege de complexe structuur van de celmembraan en het differentieel protein Steigerconstructies tussen volwassen CMS en NRVMs of heterologe cellijnen, de mogelijkheid om volwassen cellen patch geeft een betere weergave van de gevolgen van bepaalde membraaneiwitten, structurele eiwitten, en ionkanaal interactie partners over de elektrofysiologische componenten van het volwassen hart.
Ondanks deze prominente voordelen in het bestuderen van volwassen muizen hartspiercellen, het isoleren en kweken van volwassen muizen hartspiercellen is uitdagend en drong de noodzaak van een systematische en nauwkeurige omschrijving van de methodologie om levensvatbare muis hartspiercellen te isoleren en ze te handhaven in de cultuur om verdere genetische manipulatie mogelijk maken met behulp van virale vectoren. Eerdere studies hebben gebruikt ofwel acuut geïsoleerd muis volwassen CMS of gekweekte ratten volwassen CMS. De laatste zijn gemakkelijker te cultuur dan volwassen muis CMs, en de meeste experimenten manipuleren van genexpressie in vitro hebben gebruikt rat volwassen CMS. Weinig studies hebben met succes veranderd en onderzocht functionale genexpressie in muizen volwassen CM's, die een grote beperking van de reikwijdte van de experimenten. Daarom, hier geven we in detail dergelijke methodieken, gewijzigd ten opzichte van eerdere onderzoeken, voor de isolatie 7,8,22, cultuur 3,10,15,23, adenovirale infectie 11-13,15, en functionele analyse van volwassen muis ventriculaire cardiomyoctyes. Deze isolatieprotocol resulteert in Ca2 +-tolerante, prikkelbare cardiomyocyten dat we met succes gekweekt gedurende maximaal 72 uur en transiënt getransfecteerd met adenovirus. De functionaliteit van deze geïsoleerde cellen kunnen worden beoordeeld met het MMSYS beeldvormingssysteem 14,24 en patch clamp, die ook zal worden besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit verslag hebben we de technieken die noodzakelijk zijn voor een succesvolle isolatie en kweek van volwassen CMS in het muizenhart beschreven. De techniek maakt vervolgstudie CM functie en prikkelbaarheid volgens de hierboven beschreven werkwijzen. De kritische parameter voor het bestuderen functionaliteit van volwassen CM is de gezondheid en de geïsoleerde CM. Zoals hierboven beschreven, onze technieken maken een hoge opbrengst van functionele cellen die vatbaar zijn voor manipulatie van genexpressie met adenovir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
References
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O’Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -. S. . Methods in Molecular Biology. 689, 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
