遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。
Optogenetic方法が種の幅広い行動の多様なセットの基礎となる神経回路の活動を解明するための強力なツールとして浮上している。微生物起源のOptogeneticツールは、行動関連のタイムスケール上で( 例えば 、チャネルロドプシン2、ChR2を)または沈黙( 例えば 、ハロロドプシン、NpHR)神経活動ingenetically定義セル型を活性化することができる感光性膜タンパク質で構成されています。まず、背側海馬台とラットの前頭前野の縁前方の領域へのChR2およびNpHR導入遺伝子のアデノ随伴ウイルス媒介送達のための簡単な方法を示しています。 ChR2をとNpHRが遺伝的に標的化可能であるため、我々は神経細胞の特定の集団高い時間精度で異質な組織に埋め込 まれて( つまり 、錐体ニューロン)の電気的活動を制御するには、この技術の使用を記載している。我々は、ここにカスタムソフトウェアをハードウェアについて説明しますユーザー·インターフェース、およびin vivoでの準備、麻酔中の形質導入錐体細胞からの同時光配送および電気的記録を可能に手続き。これらの光応答ツールは、情報処理や行動への異なる細胞型の寄与原因を特定するための機会を提供する。
一時的に正確な方法で神経回路内の特定の細胞型を有効にするか沈黙させる能力は、神経回路が感情と認知の基礎となる様々なタイプの情報を処理する方法を理解するために重要です。そのまま神経活動上の実験制御が用意されていませんloss-/gain-of-functionツール( 例えば 、電気刺激、薬理学的調節、病変)を採用したか、時間的または空間的な規模で、神経細胞の特定の集団を制御するために、選択的に必要。直接これらの技術的な課題に対応する、遺伝的にコード化可能感光性ツールの開発とアプリケーションは、明確に定義された行動のイベント中に選択した細胞型の電気的活動を制御する神経科学者を可能にしました。これらの感光性タンパク質の多くはhalorhodop、光依存性カチオンチャネル、チャネルロドプシン2(ChR2を)1、および光駆動塩化ポンプで、微生物由来のものである広く使用されている罪(NpHR)2,3、。
光遺伝学の主要な利点は、不均一な脳領域および技術における遺伝的に標的特異的細胞集団への能力は、正常モデル生物(ヒト以外の霊長類の無脊椎動物)4-6の数に適用されている。多くのoptogeneticトランスジェニック動物は、しかしトランスジェニック系統を確立することは、労働集約的でコスト法外ことができ、生成され、7,8、市販されているされています。ここでは、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてラットの縁前方の皮質と背側海馬台におけるCaMKIIαプロモーター下にChR2およびNpHR遺伝子の、ウイルス媒介性送達するためのプロトコルを記述します。前脳内では、CaMKIIα式はグルタミン酸作動錐体ニューロン9に排他的である。 AAVは、一般的に、その相対的な生産および病原性の欠如のしやすさだけでなく、基礎研究のために使用される強力かつpersiこれらのベクター10で達成されたステントの導入遺伝子の発現。さらに私たちは、麻酔をかけた頭を固定したラットの同時光伝達と記録するための手順やハードウェアの概要を説明します。
技術の広い配列は、げっ歯類での個別の脳領域に微生物オプシンの遺伝子を遺伝的に標的とするための利用可能です。ウイルス遺伝子送達は、細胞型特異性でのChR2およびNpHR表現を仲介するため、比較的安価で迅速なアプローチを提供します。 AAVベクター系は、貯蔵中に安定なままで高い生産力価、病原性の欠如、および長期的な遺伝子発現10を産生するその能力にoptogenetic実験に使用するための共通の選択である。細胞型特異的プロモーターとオプシン構築物の多くは、ペンシルバニア大学(などのベクター中核施設からのAAV血清型の様々な商業的に入手可能であるhttp://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore )または大学チャペルヒル校、ノースカロライナ( http://genetherapy.unc.edu )。 AAV技術の欠点の1つである細胞特異的ターゲッティングのために使用することができる導入遺伝子カセットのサイズに制限を置く限られたパッケージング能力(〜4.7キロバイト)。代替として、より大きなパッケージング能力を有するレンチウイルスベクターは、より大きなプロモーター配列の制御下に標的化オプシンを収容することができる。
オプトロードの使用は、時間的に正確な光の送達と組み合わせて、電気生理学的信号の確実な検出を可能にする。しかしながら、上述したように、十分な注意は、その構築に必要とされる。切断された光ファイバは壊れやすいので、きつく縫合糸を接続すると、繊維が破損する恐れがあります。送られる光の電極と品質のインピーダンスが低下しますので、オプトロードは、複数の記録に使用することができるにもかかわらず、電極および光ファイバを挿入する前に洗浄(または手動で光ファイバ裸の終了などの場合切断される)する必要があります繰り返し使用した。
エレメントの間にctrophysiologicalレコーディングにはオプトロードをゆっくり前進することが重要です。 (:125ミクロン、光ファイバのコア:タングステン電極を200μm)、ここで使用されるオプトロードは、約350ミクロンの厚さを有しており、すぐにそれを低下させることが脳組織の動きにつながる可能性があります。光誘起アーティファクトは、特定の記録と光配信のセットアップ11月12日であると考えている可能性があります。我々は我々の実験条件では光によって誘発されるアーティファクトを発見したが、形質導入脳領域外の録音は、潜在的に光のアーティファクトのコントロールとして使用することができます。記録プロセス中の別の考慮事項は、特に長い持続時間記録のために、またはChR2をNpHR発現ニューロンの変化を観察するために必要な光強度である。強力なレーザー強度と長いレーザー照射は組織損傷および/ または12月13日以降のお届け光に減少した応答をもたらす可能性があります。行動実験のためのコントロールウイルスベクターを使用することがeliminatinに必要ですグラムの繊維から配信熱による影響。市販のoptogenetic構築物の多くはオプシン遺伝子配列が除去された相補的な制御構造が存在する。
それは、ChR2を、特定の実験の質問14〜15により適しているであろう他のサイレンオプシンと一緒に開発されており、改善された特性と動態変異体設計に留意すべきである。例えば、「ケタ」と呼ば標的突然変異誘発を介して確立新しいChR2を変異体は、元のChR2 14のそれより上(少なくとも200ヘルツまで)の周波数で高音質の神経スパイクを駆動することができます。
in vivoでの光伝達および神経細胞応答の同時録画の組み合わせは、遺伝的に標的とする細胞集団とそれに対応する時間がロックされた行動のイベントでパターン化された活動との因果関係を確立する上で重要なステップです。手続きおよびHAここで概説rdwareはげっ歯類では、生体内のヘッド固定記録のために光遺伝学を実装するための簡単な方法を提供する。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、薬物乱用研究所(NIDA)助成R01 DA24040(DCC)、コロラド大学の革新的なシード·グラント(DCC)、およびNIDA訓練助成T32 DA017637(MVB)によってサポートされていました。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |